乙型肝炎表面S_前S1融合基因转_省略_hfr_的细胞染色体变化及致瘤性_田淑芳
乙肝病毒前S1蛋白与HBV DNA定量检测的关系
乙肝病毒前S1蛋白与HBV DNA定量检测的关系乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病，我国是乙型肝炎的高流行区。
前S1和前S2蛋白可以作为表达病毒复制的新标志，并提示两者可能均参与到病毒对肝细胞的附着过程。
前S1蛋白位于病毒颗粒表面，在病毒感染、复制、刺激机体产生免疫反应方面以及对乙型肝炎患者的诊断、治疗和预后均有重要参考意义。
为进一步探讨前S1蛋白与乙肝血清标志物(HBV-M)、HBV DNA的关系，对收集的急、慢性乙肝患者的血清进行了研究，报告如下：1．材料与方法1．1标本急、慢性乙肝病人149例，均为2008年4月～2009年11月来我院就诊的门诊患者及住院患者，所有患者符合全国病毒性肝炎学术会修订的诊断标准。
其中男性88例，女性61例，年龄19～82岁，平均年龄为44岁。
HBsAg阴性标本40例选自健康体检人员。
收集血清标本，-20℃保存，待检。
1．2试剂和仪器1．2．1 试剂HBV-M检测试剂盒购于上海实业科华生物技术有限公司，Pre-S1检测试剂盒购于中国科学院上海阿尔法生物技术有限公司，HBV DNA检测试剂盒购于深圳市匹基生物工程股分有限公司。
1．2．2仪器HBV DNA定量Roche公司产生的Light cycler荧光定量PCR仪。
酶标分析仪：奥地利生产的anthos2010酶标分析仪。
1．3方法1．3．1 HBV-M、前S1蛋白检测均采用ELISA法，严格按照试剂说明书操作结果由酶标仪判读。
HBV DNA检测采用荧光定量PCR法，严格按照仪器及试剂说明书操作。
1．3．2 统计学处理采用四格表卡方检验，P<0．05为差异具有统计学意义。
2．结果2.1健康对照组对HBsAg阴性的健康对照组的40例血清进行前S1蛋白和HBV DNA的检测，检测结果显示前S1蛋白均为阴性，HBV DNA定量均低于检测限。
2.2 113例乙型肝炎病毒感染者检测HBV-M及前S1蛋白检测结果见表1。
乙型肝炎前 S1、S2抗原与 HBV-DNA的相关性分析
ＨＵＡＮＧ Ｙａ ｎ ｐ ｉ ｎ ｇ ，ＺＨＵ Ｆ ｅ ｎ ｇ ，ＷＡＮＧ Ｘｉ ｎ ｙ ｕ ａ ｎ， Ｚ ＯＵ Ｈａ ｏ ｌ ｉ ｎ，ａ ｎ ｄ ＸＵ Ｎｕ ｏ ． Ｄｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ，Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉＢ Ｖ ． Ｄ Ｎ Ａ载量和 ＨＢ Ｖ感染类 型角度对 Ｈ Ｂ Ｖ — Ｄ Ｎ Ａ和前 ｓ １ 、 ｓ ２抗 原检 测结果进 行分 析。结果 乙肝
大 三 阳患 者 乙肝 前 Ｓ １ 、 Ｓ ２抗 原 和 ＨＢ Ｖ 。 Ｄ Ｎ Ａ 阳性 率 分 别 为 ９ ８ ． ４ ８ ％、 ９ ５ ． ４ ５ ％、 １ ０ ０ ． Ｏ ％； 小 三阳患者乙肝前 Ｓ １ 、 ｓ ２抗 原 和 Ｈ Ｂ Ｖ— Ｄ Ｎ Ａ 阳性 率 分 别 为 ５ ３ ． ２ ５ ％ 、 ４ ５ ． ４ ５ ％ 、 ４ ６ ． ７ ５ ％。Ｈ Ｂ ｓ Ａ ｇ （＋） ＨＢ ｅ Ａ ｂ （＋） 患者 乙肝前 ｓ １ 、 ｓ ２抗 原 和 Ｈ Ｂ Ｖ － Ｄ Ｎ Ａ 阳性 率 分 别 为
ｍｉ ｎ ｅ ｄ ｂ ｙ ＥＬ Ｉ Ｓ Ａ ａ ｎ ｄ ＨＢ Ｖ— ＤＮＡ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ ｉ ｎ ４ ２ ０ ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ＨＢＶ ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｓ ｅ ｐ ｔ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ２ ０１ ３ ｔ ｏ Ｍａ ｙ ２ ０ １ ４ ． ＨＢ Ｖ ，Ｐ ｒ ｅ — Ｓ １ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ａ ｎ ｄ Ｐ ｒ ｅ — ｓ ２ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ｒ ｅ ｓ ｕ ｈ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｎ ￣ｙ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ａ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｓ ，ｓ ｕ ｃ ｈ ａ ｓ ｓ ｅ ｕ ｍ ｒ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ｅ ｓ ，ＨＢ Ｖ・ ＤＮＡ ａ ｍｏ ｕ ｎ ｔ ｓ ｎｄ ａ ＨＢ Ｖ・ ＤＮＡ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｙ ｐ ｅ ｓ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｉ ｎ “ｂ ｉ ｇ ｓ ｎｙ ａ ａ ｎ ｇ ”ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ｔ ｈ ｅ ｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ ０ ｆ Ｐ ｒ ｅ — Ｓ １ ．Ｓ ２ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ａ ｎ ｄ ＨＢＶ — Ｄ ＮＡ ｗ ｅ ｒ ｅ
乙型肝炎病毒前S1抗原研究进展
乙型肝炎病毒前S1抗原研究进展乙型肝炎病毒(HBV)通过血液、母婴密切接触和性传播感染他人。
我国乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性率为7.18%(2008年中国CDC资料)，我国每年死于乙型肝炎相关疾病者约27万多人，对劳动人民的健康危害极大。
目前，对乙型肝炎的诊断是检测血清乙肝两对半、HBV-DNA以及肝功能的情况，结合临床表现综合判断。
建立一种简便、灵敏、重复性好的HBV检测试剂盒具有十分重要的意义。
近年来，开展对HBV前S1(PreS1)抗原的检测，探讨其在诊断HBV感染的临床价值。
现就其简要综述如下。
1 HBV的基因结构HBV属于嗜肝DNA病毒族，HBV-DNA基因组呈环形，由一个不完全的双链DNA组成，其中完整的链称为长链(也称负链)，其长度为3200个核苷酸(bp)组成;短链的长度可变，相当于长链的50%～80%;长链包括可被转录的4个开放读框，HBV-DNA的4个基因组全在负链上，分别为S基因、C基因、P基因和X基因，P基因与另外3个基因重叠。
S基因可分为PreS1基因和PreS2基因及S基因;1986年Thung等首先在冰冻的肝组织切片内分检出PreS1抗原，其在肝组织内表达方式与HBsAg相似，HBcAg阳性的肝组织内PreS1抗原检出率高于H BcAg阴性肝组织。
PreS1区是HBV与肝细胞膜直接结合位点，其结合力为80%。
Neurath等还用PreS蛋白抗体做阻断试验时发现肝癌细胞株HepG2细胞有HBV特异性受体，而PreS1蛋白对识别HepG2的HBV受体尤为重要。
2 前S1抗原的临床意义乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白包括S1、前S1和前S2 3种成分，前S1蛋白在病毒入侵肝细胞过程中起重要作用，是HBV感染和复制的新标志。
前S1蛋白是由S基因区的前S1基因表达合成，构成42 nm HBV颗粒外壳的最外层，超速离心后在42 nm HBV颗粒位置，前S1蛋白的P21-47位氨基酸残基是HBV与肝细胞膜的前S1蛋白受体的合位点，在HBV嗜肝机制中起重要作用。
高效表达乙肝表面S(主蛋白)和前S1(大蛋白)融合抗原的转基因哺乳动
专利名称：高效表达乙肝表面S(主蛋白)和前S1(大蛋白)融合抗原的转基因哺乳动物细胞系
专利类型：发明专利
发明人：田淑芳,阮力,刘文军,杨芙蓉,宗芳,李军,陈红,王文,阮薇琴,王秀平
申请号：CN00123612.1
申请日：20000831
公开号：CN1309181A
公开日：
20010822
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：在乙肝表面抗原PreS1(21－47)基因片段与S基因的第223位相连的基础上在其下游引入RNA加聚A信号AATAA、乙肝病毒增强子1(En1)和增强子2(En2),及突变的x基因(mX)构成pCHBSS1G质粒。
将pCHBSS1G质粒与pSV2dhfr质粒转化到CHO－dhfr细胞,经克隆加MSX及MTX 筛选扩增,获得了高效表达乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的一系列基因工程细胞系(GdSS1－X),SS1融合蛋白在SDS－PAGE中显出27KD,30KD的蛋白条带,小鼠免疫可产生针对S和S1的特异性抗体。
申请人：中国预防医学科学院病毒学研究所
地址：100052 北京市宣武区迎新街100号
国籍：CN
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乙型肝炎病毒的基因突变与治疗
乙型肝炎病毒的基因突变与治疗乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的肝脏疾病。
虽然已经有预防措施和治疗方法，但乙型肝炎仍然是世界上最常见的慢性感染之一，威胁着全球超过2亿人口的健康。
近年来，科学家们对于乙型肝炎的基因突变及其对治疗的影响进行了深入研究，为制定更有效的治疗方案提供了重要依据。
一、乙型肝炎基因突变概述乙型肝炎是一种DNA嵌合体的RNA-加性反转录逆行转录感染。
其基因组包括四个重叠编码区域：表面抗原(S区)，心净周句核中心(核心编码C区)，P (聚合酶) 编码位点以及E净周判断(Q位点)。
这些编码区域在不同突变中发挥不同作用。
1. 基础分类：根据碳水化合物群体b分布可将基因型分成A-H，从基本组合上说明其遗传变异情况。
2. 特殊突变位点：在HBV基因中有一些特殊的变异位点，如B座的I195M、C座的T1753V、A1762T / G1764A和净库殡锥K130M等。
它们可影响病毒复制能力、感染能力、免疫逃避或发展为肝癌。
二、乙型肝炎基因突变与治疗的关系乙型肝炎基因突变对抗病毒治疗起到了至关重要的作用。
这些突变不仅会导致HBV感染进展为慢性肝炎，还增加了乙型肝炎机构抵抗核苷酸类似物(NAs)药物的风险，并且使得治疗过程更具挑战性。
1. 预测预后：针对特定的突变位点进行分析可以一定程度地预测HVB感染者乙型肝炎是否会发展为慢性和进展为肝脏相关并发症（如肝硬化和肝癌），有助于及早干预以改善预后。
2. 影响治疗效果：HBV基因突变已被证明可以减弱或完全抵消核苷酸类似物对病毒的抑制作用。
例如，A181T和M204I/V突变降低了草甘膦和恩替卡韦对HBV复制的影响。
研究发现这些突变位点可导致耐药性，并且需要调整治疗方案以应对。
三、乙型肝炎的治疗方法目前，乙型肝炎的治疗方法主要包括干预母婴传播、基因与免疫治疗以及药物治疗等方面。
1. 干预母婴传播：乙型肝炎的主要传播途径之一是母婴传播，通过采取相应措施可以有效减少感染率。
乙型肝炎的基因修饰治疗研究进展
乙型肝炎的基因修饰治疗研究进展乙型肝炎（Hepatitis B，HBV）是一种由乙型肝炎病毒引起的肝脏感染疾病，全球范围内乙型肝炎的患病率仍然很高。
虽然疫苗的广泛使用和抗病毒药物的进展已经在乙型肝炎的防治中取得了显著的成就，但是乙型肝炎仍然是全球肝炎相关疾病的主要原因之一，严重威胁着全球公共卫生。
乙型肝炎病毒的基因组结构复杂，包含有一个双链DNA分子。
该分子的编码区域主要包括四个重要的基因：S基因、C基因、P基因和X基因。
S基因编码表面抗原（HBsAg），是乙型肝炎病毒感染的标志物；C基因编码核心蛋白（HBcAg），参与病毒复制和组装；P基因编码聚合酶蛋白（HBeAg），在病毒复制过程中起关键作用；X基因编码X蛋白，参与乙型肝炎病毒的增殖和肿瘤发生。
基因修饰治疗是一种新兴的治疗策略，通过改变乙型肝炎病毒基因的表达和功能，从而抑制病毒复制、减轻病毒感染对机体的损害。
近年来，基因修饰治疗在乙型肝炎的研究中取得了一定的进展。
首先，基因沉默技术是基因修饰治疗的一种重要手段。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种通过转录后基因沉默的方式，抑制靶基因的表达。
研究人员利用RNAi技术，成功抑制了乙型肝炎病毒的基因表达，从而减少了病毒复制和感染。
其次，基因编辑技术也为乙型肝炎的治疗提供了新的思路。
CRISPR-Cas9系统是一种高效的基因编辑工具，可以精确地切割乙型肝炎病毒基因组，并进行修饰。
研究人员利用CRISPR-Cas9系统，成功地切割了乙型肝炎病毒的基因组，并实现了病毒基因的修饰和删除。
此外，基因治疗还包括基因替代和基因增强等策略。
基因替代是指将正常的基因导入到患者体内，以取代缺陷基因的功能。
研究人员通过基因替代技术，成功地将正常的乙型肝炎病毒基因导入到感染者体内，恢复了病毒感染后的免疫应答。
基因增强是指通过改变宿主细胞的基因表达水平，增强机体对乙型肝炎病毒的抵抗能力。
研究人员通过基因增强技术，增强了宿主细胞对乙型肝炎病毒的抗病毒能力，从而减轻了病毒感染的程度。
反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达
反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达邓益斌;温旺荣【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2013(033)006【摘要】目的探讨针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用.方法针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区,利用RNA structure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S1抗原的含量；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S1抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别达65.99％、67.49％和63.88％.LNA对细胞代谢无明显影响.结论针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.【总页数】4页(P722-725)【作者】邓益斌;温旺荣【作者单位】右江民族医学院附属医院医学检验中心,广西百色533000;暨南大学第一附属医院医学检验中心,广东广州510070;暨南大学第一附属医院医学检验中心,广东广州510070【正文语种】中文【中图分类】R961【相关文献】1.反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达 [J], 罗艳红;邓益斌;邹佳峻2.反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断乙肝病毒C基因表达 [J], 邓益斌;温旺荣3.反基因锁核酸在转基因小鼠体内抗乙肝病毒的短期效果 [J], 韦武均; 陈晓昊; 肖树荣; 邓益斌; 许桂丹; 彭彬; 农顺强; 胡仁统; 黄晶晶; 韦家柱4.针对HBV preS1、preS2编码链的反基因锁核酸对HepG2.2.15细胞的抗病毒效果 [J], 彭彬;许桂丹;韦武均;农顺强;陈晓昊;肖树荣;邓益斌5.HBV preS1反基因锁核酸的设计及体外对病毒复制的抑制 [J], 邓益斌;温旺荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乙型肝炎病毒前S1抗原与HBV-DNA和HBeAg的相关性分析
乙型肝炎病毒前S1抗原与HBV-DNA和HBeAg的相关性分析既往研究中显示前S1抗原主要存在于血清HBV表面，前S1抗原与HBV-DNA、HBeAg检测率高度符合，是一项十分重要的病毒复制指标，可作为HBeAg和HBV-DNA检测的补充和对照。
本实验通过荧光定量PCR检测HBV-DNA及用酶联免疫法(ELISA)检测HBeAg，Anti-HBe及前S1抗原，对前S1抗原与HBV-DNA，HBeAg进行相关性分析，探讨前S1抗原在乙型肝炎病毒检测中的意义。
1 材料和方法1.1对象本组对象为在我院治疗的207例乙型肝炎患者，乙肝表面抗原(HB-sAg)阳性，年龄12～70岁，中位年龄42岁。
对照组为80例健康体检者，年龄22～60岁，中位年龄40岁，乙型肝炎病毒标志物均为阴性。
且ALT，AST水平在正常范围内。
1.2标本采集空腹下取静脉血3 mL，3000 r／min离心10 min，分离血清检测用。
1.3仪器和试剂采用深圳匹基生物工程有限公司的HBV-PCR荧光定量检测试剂盒，用Roche Light Cycler荧光PCR检测仪检测HBV-DNA；用上海科华生物有限公司提供的试剂盒检测HBeAg、Anti-HBe；用上海复星长征医学科学有限公司提供的试剂盒检测前S1抗原。
1.4检测方法1.4.1 HBV-DNA的检测HBV-DNA采用实时荧光定量PCR法检测。
①标本处理。
②扩增试剂制备及加样：HBV-PCR反应液、Taq酶及VNG。
③PCR扩增：扩增产物与特异的寡核苷酸探针进行杂交。
④测定与探针结合的扩增产物，测定的线性范围为1.0×103～5.0×107copies／mL，若检测标本大于5.0×107copies／mL，报告为>5.0×107copies／mL。
1.4.2 前S1抗原、HBeAg、Anti-HBe的检测：采用酶联免疫法。
1.4.3 80名乙肝病毒标志物均为阴性的健康人血清再测前S1抗原。
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基金项目:863高科技发展计划资助项目(863-218-01)作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所遗传免疫室#论著#乙型肝炎表面S+前S1融合基因转化CHO-dhfr-的细胞染色体变化及致瘤性田淑芳阮薇琴王秀平张陵林杨芙蓉宗芳阮力=摘要>目的了解乙型肝炎病毒表面S+前S1融合重组DNA(乙型肝炎重组DNA)整合到中国地鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶阴性突变株细胞(CHO dhfr-)染色体的变化及致瘤性。
方法应用分子克隆技术构建含HBsAg的表面抗原S+前S1基因的质粒经转染、克隆、加压(MTX和MSX)筛选出高效表达乙型肝炎表面S+S1融合抗原的转基因细胞株(GdSS1-18)进行染色体制片,同时将制备的细胞、细胞DNA和细胞匀浆皮下接种裸鼠观察3周。
结果整合了外源乙型肝炎重组DNA的转基因细胞系(GdSS1-18)不同的传代均发生染色体结构畸变,畸变率为11%,56%及29%,而未整合外源乙型肝炎重组DNA的对照C HO d hfr-细胞为6%,二者的染色体众数无明显变化,均为20条。
整合与未整合外源重组DNA的细胞接种裸鼠以后观察3周均无肿瘤生长。
结论整合有外源乙型肝炎重组DNA的细胞株(GdSS1-18)其染色体结构畸变率高于未整合的CHO-dhfr-对照细胞,但二者的染色体众数仍为20条;不同代数GdSS1-18细胞产物接种裸鼠后未见肿瘤的生长。
=主题词>肝炎表面抗原,乙型;仓鼠;卵巢;染色体畸变;致瘤性Chromosome aberration and carcinogenicity of CHO dhfr-cells transformed by plasmid containing S+and Pre S1of fussion gene of hepatitis B virus TIAN Shu fang,RU AN Weiqin,WANG Xiuping,et al.Instituteo f Virology,Chinese Academy o f Preventive Me dicine,Bei j ing100052,China=Abstract>Objective To investigate the chromosome aberrations and carcinogenicity of CHO-dhfr-cellinduced by integration of plasmid contai ning S+and Pre S1fusion gene of hepati tis B surface an tigen(HBs Ag).Methods The plasmid pC HBSS1G was constructed with S+Pre S1of HBsAg.C HO-dhfr-cells were transformedwi th this recombinant plasmid DNA and CHO cells li nes with integrated DNA were cloned and named GdSS1-18.The GdSS1-18cell lines secreting the S+Pre S1fusion protein of HBs Ag at high level were developed by screen-ing in increased concentration of MTX and MSX in cultured media.To make sample of cells chromosome,the cells integrated DNA were subcutaneously injected into nude mouse.Results The C HO-dhfr-cell lines integrated wi thS and Pre S1fusion protein of HBs Ag were developed and named GdSS1-18cell li nes.The frequencies and type of chromosome aberrations of the GdSS1-18cell lines with differen t passage generations were11%,56%and29%, respectively,while that of the control C HO-dhfr-cell lines was6%.There was no change in the mode of chromo-somes,both cell lines having20chromosomes.Both cell lines were non-oncogenic in nude mouse.Conclusion The chromosome aberration of CHO-dhfr-cells with integrated DNA were obviously higher than that of the originalCHO-dhfr-cells without integrated DNA.Both cell lines were non-oncogenic i n nude mouse.=Key words>Hepatitis B surface anti gens;H a msters;Ovary;Chromosomal aberrations;Carcino-genicity60年代初就报道了应用中国地鼠研究动物病毒对其染色体畸变的影响112,随后一些作者研究发现体外培养的CHO细胞经限制性切酶作用后也发生染色体畸变12,32,本文为乙型肝炎表面抗原S+和Pre S1融合的基因的重组质粒转化C HO-dhfr-细胞后染色体畸变及其致瘤性的研究。
1材料和方法111质粒含乙型肝炎表面抗原S+和Pre S1融合基因及二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因的重组质粒pC HBSS1G由中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室构建。
其特点是:SS1融合基因及GS扩增基因分别用C MV及SV40启动子作为调控序列。
112细胞系及细胞培养C HO-dhfr-细胞系由美国哥伦比亚大学Chasin教授惠赠。
收到时已传了100代左右,该细胞是C HO P C HO pro-(pro-表示需脯氨酸)细胞经多次化学和物理因子诱发而成的营养缺陷型细胞,其特点是细胞2个同源染色体的二氢叶酸还原酶(Dihydrofolic acid reductase)基因完全缺失,在含脯氨酸,次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷酸的培养液中才能正常生长14-62。
GdSS1-18P34细胞:是病毒所遗传室用含有乙型肝炎表面抗原S+Pre S1融合基因质粒PCHBSS1G与PSV2dhfr质粒共转化到CHO-dhfr-细胞,经克隆筛选而获得的表达含有S+ Pre S1融合抗原的转基因细胞系172。
GdSS1-18-60:系由GdSS1-18-P36代的细胞经转瓶连续培养60d 后再传15代。
GdSS1-18-12:系由GdSS1-18P32代的细胞经亚克隆后再传12代。
HeLa细胞由病毒所遗传室提供。
上述4系细胞的培养用含10%小牛血清及常规的PS的L-D ME M培养液(内含谷氨酸和天冬酰氨及1L m的MTX,100L m的MSX。
HeLa细胞培养液:用DME M加10%小牛血清,37e培养。
113细胞染色体标本的制备向含10ml培养液的细胞中加终浓度为01008%的秋水仙素摇匀后置37e培养215h,按文献182制备染色体标本,即细胞经胰酶消化后沉淀,弃上清后再重悬于6ml的01075mol低渗KCl溶液中(37e2h)使细胞胀大,破裂,释放出染色体,直接加入1ml新配制的固定液(甲淳B冰乙醇=3B1)混匀,离心,去上清后再加6 ml固定液混匀室温固定20min,离心,弃上清,反复固定3次,加入适量的固定液115ml,混匀,滴片,吹散后立即蒸气熏蒸2s,置Gie msa染色5min,漂洗,干后镜检。
114细胞致瘤性试验用0125%无钙、镁离子的胰酶消化细胞,离心去上清,沉淀重悬,计数,细胞经超声裂解后制成匀浆,按表3中的剂量注入裸鼠背部皮下,观察3周,细胞DNA的提取按文献192。
2结果2114系C HO细胞染色体的变化结果见表1。
在观察的100个细胞中,无乙型肝炎重组DNA整合的C HO-dhfr-细胞,其染色体及有乙型肝炎重组DNA整合的GdSS1-18#细胞及其染色体集中波动在18~28之间,染色体的众数20,占各代细胞总和数的4318%,表明外源基因的整合与否不影响其染色体众数(众数为20)。
2124系细胞染色体畸变的观察结果见表2。
从表中看出,从100个细胞计数中CHO-dhfr-细胞染色体畸变率为6%,有乙型肝炎重组DNA整合的GdSS1-18细胞为11%,GdSS1-18-60为56%,GdSS1-18-12细胞为29%。
在C HO-dhfr-细胞中观察到的细胞畸变类型有:单体断裂(M-CB)、双着丝粒(D-CC)及双微体(D-M)。
而整合了乙型肝炎重组DNA 的GdSS1-18,GdSS1-18-60,GdSS1-18-12等细胞的染色体也出现结构性畸变,而它们的结构性畸变及畸变类型都高于C HO-dhfr-细胞。
结构性畸变率分别为11%,56%,29%。
畸变类型除上述外还有双体断裂(D-CB)、核内复制(E)、环状等(RC),见图1。
用107GdSS1-18细胞皮下接种5只5周龄的Balb P c小鼠,接种后3周未见肿瘤生长,除活细胞外,同时用GdSS1-18细胞的均浆液及细胞DNA等不同的细胞产物接种裸鼠皮下均未发生肿瘤生长。
而接种细胞数少10倍的HeLa细胞(106)5只裸鼠全部生瘤,He-la等细胞致瘤性结果见表3。
表明,GdSS1-18细胞虽然染色体畸变率有所增加,但染色体的众数没有变,仍为20条,并无致瘤性。
3讨论目前乙型肝炎的有效预防措施主要是应用乙型肝炎基因工程疫苗,此疫苗主要是含乙型肝炎表面S抗原。
为提高现有乙型肝炎基因工程疫苗的免疫性及其抗病毒的保护作用,我们构建了含乙型肝炎表面S及前S1融合抗原的转基因细胞系172。
结果表明GdSS1-18和CHO-dhfr-的染色体众数无明显变化(为20条),但染色体的结构变异却有差异。
这种差异可能是由于重组DNA掺入后,整合在某1条或某几条染色体上,尽管整合的位置尚不清楚,然而这种整合会导致染色体重排或畸变,从而引起细胞遗传学上的变化。