实验十二 大肠杆菌生长曲线的制作
大肠杆菌生长曲线实验报告
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。
测量时要等数字变化不大时再读取，可以读三次，最后取平均值，这样能保证实验结果更加准确。
721型分光光度计要先预热，实验过程中最好使用同一台仪器，同一个比色皿，这样可以减少仪器误差，分光光度计的使用操作要规范。比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。比色皿用擦镜纸擦干净，上面不要残留有纸纤维和水珠等。
延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。
对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。
改进措施:在试验过程中应严格按照标准的操作要求，在上述步骤时更加应该规范操作。
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2.营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min.
大肠杆菌生长曲线的测定
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本实验采用分光光度计进行光电比浊测 定不同培养时间细菌悬浮液的光密度值， 绘制生长曲线。
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光吸收的基本定律：朗伯－比耳定律 A=kbc (k为摩尔吸光系数，b为液层厚度，c为溶液浓度)
朗伯－比耳定律的意义是：当一束平行单色光通过均匀、非散 射的溶液时，其吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
大肠杆菌Байду номын сангаас长曲线的测定
授课教师: 孙运军 研 究 生: 何浩 张晨
黄同龙 左明星
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目的要求
1、通过光密度值的测量了解大肠杆菌的生 长规律，绘制生长曲线。
2、了解光电比浊法测量细菌数量的原理。
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基本原理
将一定量的细菌接种到恒容积的液体培养基 中，在适宜的培养条件下，该群体就会有规律的 增长。以培养时间为横坐标，以细胞数目的对数 或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细 菌的生长曲线。该曲线包括四个阶段：延滞期、 指数期、稳定期、衰亡期。
不同培养时间的菌液
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OD600 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20
2.5 2
1.5 1
0.5 0 培养时间
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OD600 OD600校正
注意事项：
1. 选用规格一致的试管； 2. 每支试管的装液量应相同(5 ml/支)； 3. 混匀的菌悬液加入到比色皿后应迅速读取OD值； 4. 保护比色皿透光面不受磨损，不要用手指直接接触； 5. 分光光度计在未测样品时应及时打开盖。
床、无菌试管、无菌吸管。
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大肠杆菌生长曲线的测定 PPT
黄同龙 左明星
目的要求
1、通过光密度值的测量了解大肠杆菌的生 长规律，绘制生长曲线。
2、了解光电比浊法测量细菌数量的原理。
基本原理
将一定量的细菌接种到恒容积的液体培养基 中，在适宜的培养条件下，该群体就会有规律的 增长。以培养时间为横坐标，以细胞数目的对数 或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细 菌的生长曲线。该曲线包括四个阶段：延滞期、 指数期、稳定期、衰亡期。
3、用5 ml无菌吸管取2.5 ml大肠杆菌培养液(培养12h)转入装有 LB液体培养基的三角瓶内，混匀后分别取5ml混合液放 入上述标记的11支无菌大试管中。
4、将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(200 rpm)，在相应时间 取出试管放于冰箱中，最后一同测定OD600值。
5、进行光密度测定时，以未接种的LB液体培养基为空白对照， 从早取出的培养液开始依次测定，细胞密度大的培养液用LB 液体培养基稀释后测定，使OD600值在0.1~ 0.65之内。
床、无菌试管、无菌吸管。
大家应该也有点累了，稍作休息 大家有疑问的，可以询
10
操作步骤
1、配制LB液体培养基100 ml，分装1支试管(5 ml/支)，剩余培养 基装入250 ml的三角瓶，121℃灭菌20min。
2、取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、 3、4、6、8、10、12、14、16和20 h。
本实验采用分光光度计进行光电比浊 测定不同培养时间细菌悬浮液的光密度值， 绘制生长曲线。
光吸收的基本定律：朗伯－比耳定律 A=kbc (k为摩尔吸光系数，b为液层厚度，c为溶液浓度)
朗伯－比耳定律的意义是：当一束平行单色光通过均匀、非散 射的溶液时，其吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
大肠杆菌生长曲线实验报告
大肠杆菌生长曲线实验报告抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。
但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DNA对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g蛋白胨10g Nacl 5g琼脂20g蒸馏水1000ml Ph7.0 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。
大肠杆菌生长曲线实验报告-xiang
E.coli growth curve measurement一、目的1、瞭解細菌生長曲線特徵，測定細菌繁殖的代時；2、學習液體培養基的配製以及接種方法；3、反復練習無菌操作技術；4、瞭解不同細菌，不同接種方法在同一培養基上生長速度的不同；5、掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法6、複習光電比濁法測量細菌數量的方法7、學習平板塗布技術二、原理1、大腸桿菌生長：將一定量的細菌接種在液體培養基內，在一定條件下培養，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規律性，如以細菌的活菌數的對數作縱坐標，以培養時間作橫坐標，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。
圖一微生物生長曲線示意圖單細胞微生物的發酵具有四個階段，即Ⅰ調整期（延滯期）、Ⅱ對數期（生長旺盛期）、Ⅲ平衡期（穩定期）、Ⅳ死亡期（衰亡期）。
生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態。
不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養條件下，其生長曲線也不一樣。
因此，測定微生物的生長曲線對於瞭解和掌握微生物的生長規律是很有幫助的。
測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數板法、平板菌落計數法、稱重法和比濁法等。
本實驗採用比濁法測定，由於細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。
將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。
注意，由於光密度表示的是培養液中的總菌數，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。
2、平板塗布技術：塗布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用於計算活菌數，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用於檢測化學因素對微生物的抑殺效應。
原理:將一定濃度，一定量的待分離菌懸液加到已凝固的培養基平板上，再用塗布棒快速地將其均勻塗布，使長出單菌落或菌苔而達到分離或計數的目的。
其目的:用於目的微生物的分離；用於藥物的抑菌試驗；觀察菌苔的形狀和特點。
[精品]细菌生长曲线的测定
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[精品]细菌生长曲线的测定细菌生长曲线的测定是细菌学中的一项重要实验。
它可以帮助我们了解细菌的生长繁殖规律及其影响因素，为控制细菌繁殖提供理论依据。
本次实验将介绍如何通过外观观察、菌落计数及测定细菌生物量的方法，获得细菌在液体培养基中的生长曲线。
实验步骤：一、准备实验材料和试剂1、选取一种细菌菌株，本次实验选择了大肠杆菌（Escherichia coli）；2、配置好液体培养基，一般为普通营养琼脂培养基、肉汤培养基等；3、消毒好实验室的工作台面及实验仪器；4、准备好移液管、试管、比色管和加热消毒的线圈镊子等实验用具。
二、制备不同浓度的菌液1、挑选一根菌棒，从培养基上接入一些带有细菌的菌落，将菌落均匀涂抹于培养基表面；2、将含有细菌的培养基放置在恒温摇床中，在适宜的温度下进行培养；3、当细菌生长至一定程度（一般在对数生长期）时，用无菌的移液管，在培养基中取出一定量的菌液；4、分别将不同体积的菌液加入到含有培养基的试管中，制备成不同浓度的菌液。
三、测定不同浓度菌液对应的OD600值1、将制备好的不同浓度菌液放入洗涤过的比色管中；2、由于细菌太小，肉眼观察不能得出其数量的增多或减少，因此需要使用分光光度计在600nm处测量各个浓度的菌液的吸光度（OD）值；3、重复测量3次，取平均值计算OD600；4、根据OD600值和菌液中细胞数量的线性关系，可通过OD600值推算出细胞数。
2、每隔2-3个小时，取出一定量的菌液，测量其OD600值，记录下菌液对应时间的值；3、采用计数培养法，每隔一定时间取出一定体积的菌液，进行菌落数的计数；4、利用OD600值曲线和菌落数曲线绘制出细菌生长曲线。
实验注意事项：1、实验期间需在无菌条件下操作，防止细菌的外界感染对实验结果的影响；2、实验者需佩戴适当的防护手套及实验服，以免对人体造成伤害；3、制备好菌液后需要及时放置在摇床中，防止菌落外的细菌感染进去；4、测量OD600值时比色管必须清洗干净，用甲醇或无菌去离子水。
大肠杆菌生长曲线的测定概要
大肠杆菌生长曲线的测定一、基本原理生长曲线是微生物在液体培养基中所表现出来的生长、繁殖的规律，不同的微生物表现为不同的生长曲线，而即使是同一种微生物在不同培养条件下，其生长曲线也不同。
因此测定微生物的生长曲线对于了解，掌握微生物的生长规律是有帮助的。
由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。
本实验是以活菌计数法与光电比浊法相对应来测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线，从而观察分析大肠杆菌在这些培养条件下的生长情况。
二、器材培养了20小时的大肠杆菌悬液；肉汤蛋白胨培养基（液体、固体）；浓缩的肉汤蛋白胨液体培养基（浓缩5倍）；无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝3：1：1）。
1毫升及5毫升无菌吸管；无菌试管；无菌生理盐水；无菌平皿；血球计数器；显微镜；光电比色计；无菌离心管；离心机等。
三、操作步骤1．将经20小时培养的大肠杆菌培养物，倒入无菌离心管内离心（3000r.p.m×10），以无菌生理盐水洗涤三次后，制成约9亿毫升的菌悬液（用显微镜直接计数法），作为种子。
上述过程都必须注意严格无菌操作。
2．取盛有200毫升培养基经灭菌的三角瓶三瓶，分别标明A、B、C，按5%接种量，将上述种子接入，置37℃振荡培养。
在B瓶培养了4小时后取出，加入10毫升无菌酸溶液，然后继续振荡培养。
在C瓶培养了6小时后取出，加入10毫升无菌浓缩肉汤蛋白胨液，再继续振荡培养。
3．间隔一定时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20小时后，从A、B、C三角瓶中各取5毫升菌液放于无菌试管中，置冰浴。
并作适当稀释，使菌悬液的光密度控制在0.0－0.4范围内，再置光电比色计中进行比浊测定（400－440毫微米波长），用未接种的肉汤蛋白胨液为空白对照。
记下光密度值。
另外，A管在比浊测定以前，以无菌操作吸取0.1毫升菌液于肉汤蛋白胨琼脂平板上，用玻璃刮棒涂抹均匀后，置37℃培养30小时后计数。
大肠杆菌生长曲线的制备
大肠杆菌生长曲线的制备一、实验目的1 了解细菌生长曲线特点及测定原理；2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、基本原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。
它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。
依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。
因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。
三、器材1菌种：大肠杆菌2培养基：LB培养基（蛋白胨10g 酵母膏5g Nacl 10g pH7.0~7.2）3仪器和器具：721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。
四、方法与步骤1种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入LB培养基中，静止培养18h作种子培养液。
2标记编号取11支无菌试管，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。
3接种培养吸取2.5ml种子液加入装有60mlLB培养基的锥形瓶中，混匀。
分别取5ml加入到11根试管，于37℃下振荡培养。
然后分别按对应时间将试管取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。
4生长量测定将未接种的LB培养基倾倒入比色杯中，选用600nm 波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
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光合细菌菌株NS的生 长曲线
三、实验器材
➢菌种 培养不同时段的大肠杆菌。
➢仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。
四、实验步骤
1.样品测试前的调试
➢开电源，仪器预热20 min，将波长调至600 nm处。
➢打开样品室，将挡光体插入比色皿架，将 其推或拉入光路。
➢盖好样品室盖，按0%键调零透射比。 ➢取出挡光体，按100%键调100%透射比。
实验十二、 大肠杆菌生长曲线的制作
一、实验目的
• 了解大肠杆菌的生长特性与规律，绘制生 长曲线
• 掌握光电比浊法测量细菌数量的方法
二、实验原理
➢生长曲线
将少量纯种单细胞微生物接种到定量的 液体培养基中，定时取样测定细胞数量， 以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作 图，得到一条反映单细胞微生物在整个培 养期间菌数变化规律的曲线。 一个典型的生长曲线分为延迟期、对数期、 稳定期和衰亡期四个时期
2.样品测定
➢将参比溶液（未接种的LB液体培养基）以及 被测溶液倒入比色皿中。
➢打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第 一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位 。
➢将参比溶液推入光路，按100%键调满度。
➢将测试方式调至吸光度方式。此时,显示器显 示“0.000”。
➢将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样 品的吸光值。
比色皿之间吸光度进行比较。
五、作业
1、结果 P88
记录不同大肠杆菌培养液的OD600值，并绘制 大肠杆菌的生长曲线。
2、思考题 第1题
根据稳定期的生长规律，可知稳定期是产 物的最佳收获期，也是最佳测定期，通过对稳 定期到来原因的研究还促进了连续培养原理的 提出和工艺技术的创建。
微生物数量的测定方法
➢平板菌落计数法 ➢显微镜直接计数法 ➢光电比浊法
➢平板菌落计数法
对样品稀释培养，据形成的菌落数计数：操作复杂。 ➢显微镜直接计数法 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。
微生物生长曲线示意图
1、延迟期
特点：生长速率常为零、菌体粗大、 RNA含量增加、代谢活力强、对不良环境 的抵抗能力下降。
成因：微生物刚刚接种到培养基之上 ，其代谢系统需要适应新的环境，同时要 合成酶、辅酶、其他代谢中间代谢产物等 ，所以此时期的细胞数目没有增加。
2、对数期
特点：生长速率最快、代谢旺盛、酶系 活跃、活细菌数和总细菌数大致接近、细胞 的化学组成形态理化性质基本一致。
在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养 基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、 16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊测 定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未接 种 的 LB 培 养 基 进 行 稀 释 ， 使 其 吸 光 值 在 0 . 1 0.65范围内。
比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品 润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面 只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。
➢光电比浊法
光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细 胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在 溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中 测定时所吸收的光线越多。
优点：简便快速，适合于自动控制。 缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。
利用一系列菌悬液测定光密度和菌数 ，制作标准曲线，再根据被测样的光密度 计算出含菌量。
成因：主要是外界环境对继续生长越 来越不利、细胞的分解代谢大于合成代谢、 继而导致大量细菌死亡。
根据微生物的生长曲线可以明确微生物的 生长规律，对生产实践具有重大的指导意义。
根据对数期的生长规律可以得到培养菌种 时缩短工期的方法:接种对数期的菌种,采用最 适菌龄，加大接种量，用与培养菌种相同组成 的培养基。
成因:经过调整期的准备，为此时期的微 生物生长提供了足够的物质基础，同时外界 环境也是最佳状态。
3、稳定期
特点：活细菌数保持相对稳定、总细菌数 达到最高水平、细胞代谢产物积累达到最高峰 、是生产的收获期。
成因：营养的消耗使营养物比例失调、有 害代谢产物积累、PH值等理化条件不适宜。
4、衰亡期
特点:细菌死亡速度大于新生成的速度、 整个群体出现负增长、细胞开始畸形、细 胞死亡出现自溶现象。