基因克隆的酶学基础
吴乃虎—基因工程原理
目录第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容第二章基因操作的主要技术原理第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节细菌转化1.肺炎球菌的转化2.大肠杆菌的转化3.细菌转化频率第四节DNA核苷酸序列分析第五节基因的化学合成第六节基因定点突变第七节基因扩增第八节研究DNA与蛋白质相互作用的方法第三章基因克隆的酶学基础第一节核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割1.寄主控制的限制与修饰现象2.核酸内切限制酶的类型3.I 型和III型核酸内切限制酶的基本特性4.II型核酸内切限制酶的基本特性[1].基本特性[2].同裂酶[3].同尾酶[4].限制片段末端的连接作用5.核酸内切限制酶的命名法6.影响核酸内切限制酶活性的因素[1].DNA的纯度[2].DNA的甲基化程度[3].酶切消化反应的温度[4].DNA分子的结构[5].核酸内切限制酶的缓冲液7.核酸内切限制酶对DNA的消化作用[1].核酸内切限制酶与靶DNA识别序列的结合模式[2].核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化作用[3].核酸内切限制酶对真核基因组DNA的消化作用第二节DNA连接酶与DNA分子的体外连接1.DNA连接酶2.粘性末端DNA片段的连接3.平末端DNA片段的连接[1].同聚物加尾法[2].衔接物连接法[3].DNA接头连接法4.热稳定的DNA连接酶[1].寡核苷酸连接测定法[2].连接酶链式反应(LCR)第三节DNA聚合酶1.DNA聚合酶I与核酸杂交探针的制备[1].DNA聚合酶I[2].DNA缺口转移[3].DNA杂交探针的制备2.大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段与DNA末端标记3.T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成5.T7 DNA聚合酶6.修饰的T7 DNA聚合酶第四节DNA及RNA的修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5’-末端的标记3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第五节核酸外切酶1.核酸外切酶VII (exo VII)2.核酸外切酶III (exo III)3.λ核酸外切酶(λ exo)和T7基因6核酸外切酶第六节单链核酸内切酶1.S1核酸酶与RNA分子定位2.Bal1 核酸酶与限制位点的确定第四章基因克隆的质粒载体第一节质粒的一般生物学特性1.质粒DNA2.质粒DNA编码的表型3.质粒DNA的转移[1].质粒的类型[2].F质粒[3].质粒DNA的接合作用4.质粒DNA的迁移作用5.质粒DNA的复制类型6.质粒DNA的不亲和性[1].质粒的不亲和性现象[2].质粒不亲和性的分子基础7.第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制1.质粒DNA复制的多样性2.ColE 1质粒DNA复制的启动3.质粒DNA拷贝数的控制[1].天然质粒拷贝数的控制[2].杂种质粒拷贝数的控制4.质粒复制控制的分子模型[1].抑制蛋白质稀释模型[2].自体阻遏蛋白质模型5.第三节质粒DNA的分离与纯化1.氯化铯密度梯度离心2.碱变性法3.微量碱变性法4.影响质粒DNA产量的因素[1].寄主菌株的遗传背景[2].质粒的拷贝数与分子大小5.第四节质粒载体的构建与类型1.天然质粒用作克隆载体的局限性2.质粒载体必须具备的基本条件3.质粒载体的选择记号[1].高拷贝数的质粒载体[2].低拷贝数的质粒载体[3].失控的质粒载体[4].插入失活型的质粒载体[5].正选择的质粒载体[6].表达型的质粒载体4.第五节重要的大肠杆菌质粒载体1.pSC101 质粒载体[1].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例一---葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达[2].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例二---在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾2.Col 1质粒载体3.pBR322质粒载体[1].pBR322质粒载体的构建[2].pBR322质粒载体的优点[3].pBR322质粒载体的改良[4].应用pBR322质粒作为基因克隆载体的实例---水稻夜绿体光诱导基因psbA的结构分析4.pUC 质粒载体[1].pUC 质粒载体的结构[2].pUC 质粒载体的优点5.其他重要的质粒载体[1].丧失迁移功能的的质粒载体[2].能在体外转录克隆基因的质粒载体[3].穿梭质粒载体第六节质粒载体的稳定性问题1.质粒载体不稳定性的类型[1].结构的不稳定性[2].分离的不稳定性2.影响质粒载体稳定性的主要因素[1].新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应[2].拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响[3].寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应3.随机分配的分子机理[1].通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平[2].通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体[3].通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生[4].大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性4.主动分配的分子机理[1].分配区的结构与功能[2].预配对模型[3].二聚体的解离有助于质粒的主动分配[4].寄主致死功能对质粒稳定性的效应5.第五章噬菌体载体和柯斯载体第一节噬菌体的一般生物学特性第二节λ噬菌体载体第三节柯斯质粒载体第四节单链DNA噬菌体载体第五节噬菌体载体第六章基因的分离与鉴定第一节DNA克隆片段的产生与分离1.基因组DNA克隆片段的产生与分离2.DNA片段的大小分部3.编码目的基因的克隆片段的富集第二节重组体DNA分子的构建及导入受体细胞1.外源DNA片段同载体分子的重组[1].外源DNA片段定向插入载体分子[2].非互补粘性末端DNA分子间的连接[3].最佳连接反应2.重组体分子导入受体细胞的途径[1].重组体DNA分子的转化或转染[2].体外包装的λ噬菌体的转导第三节基因克隆的实验方案1.互补作用基因克隆2.cDNA基因克隆[1].cDNA文库的建立[2].不同丰度mRNA的cDNA克隆[3].全长cDNA的合成[4].cDNA克隆的优越性3.基因组DNA克隆[1].应用 噬菌体载体构建基因组文库[2].应用柯斯质粒载体构建基因组文库4.基因定位克隆[1].拟南芥菜简介[2].RFLP分子标记[3].RFLP作图的原理与步骤[4].染色体步移[5].大尺度基因组物理图谱的构建第四节克隆基因的分离1.应用核酸探针分离克隆的目的基因[1].核酸探针的来源[2].寡核酸探针的的人工合成[3].假阳性克隆的克服2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因[1].差别杂交[2].差别杂交的局限性[3].扣除杂交3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因[1].mRNA差别显示的原理[2].mRNA差别显示的基本过程[3].mRNA差别显示的局限性4.引用表达文库分离克隆的目的基因5.酵母双杂交体系[1].酵母双杂交体系的基本原理[2].酵母双杂交体系的寄主菌株[3].酵母双杂交体系的实验程序第五节重组体分子的选择与鉴定1.遗传检测法[1].根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法[2].根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法2.物理检测法[1].凝胶电泳检测法[2].R-检测环法3.菌落或噬菌斑杂交筛选法4.免疫化学检测法[1].放射性抗体检测法[2].免疫沉淀检测法[3].表达载体产物之免疫化学检测法5.DNA蛋白筛选法6.转译筛选法[1].杂交抑制的转译[2].杂交选择的转译第七章基因的表达与调节第八章真核基因在大肠杆菌中的表达第一节真核基因的大肠杆菌表达体系第二节大肠杆菌的表达载体第三节克隆的真核基因在大肠杆菌中的表达第四节影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素第九章植物基因工程第十章哺乳动物基因工程第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记第二节外源DNA导入哺乳动物细胞的方法第三节SV 40病毒载体第四节反转录病毒载体第五节其他的病毒载体第十一章重组DNA与现代生物技术第十二章重组DNA与医学研究第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容1.质的新组合，并使之参与到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能够持续稳定的繁殖。
基因克隆的酶学基础
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数字表示在 不同寄主中 生长的噬菌 体的成斑率， 表示限制程 度。
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二．限制和修饰作用的分子机制
1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修 饰系统。
1） 它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS.
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定 位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受 体细胞去掉hsdR基因位点）
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② 对称性 ③ 限制酶切后产生两个末端，末端结
构是5’-P和3’-OH
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
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（3）末端种类
① 3’-端突起，个数为2或4个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
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（3）Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一 顺序的3’端24~26bp处切开DNA，所以它 的切割位点也是没有特异性的。
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二、限制性内切酶的特点 1、定义、命名
（1）定义
广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。
（2）命名
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae， “d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“Ⅲ”表示分离 到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
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2、限制酶的特点
（1）基本特点 在DNA双链的特异性识别序列部位，切割
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
基因工程概要
基因工程概要第一章：绪论让幸福的细胞不凋亡；让开心的基因多表达；让健康的质粒常转染；让快乐的双链不变异；让烦恼的片段永封闭。
一、基因工程的基本定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
二、四大里程碑遗传物质的明确——DNA；DNA双螺旋结构理论（半保留复制及其中心法则）；基因遗传密码子的破译；基因转移载体的发现。
三、三大技术发明工具酶的发明：内切酶、合成酶、连接酶；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR技术（PCR扩增仪）。
四、基因的现代概念移动基因；断裂基因；假基因；重复基因；重叠基因；或嵌套基因五、工具酶种类核糖核酸酶；脱氧核糖核酸酶； DNA连接酶；DNA聚合酶；RNA聚合酶；反转录；限制性核酸内切酶。
第二章：重组ＤＮＡ技术基础1、DNA组成与结构：核酸、一级结构、二级结构和高级结构；2、RNA的组成与功能：mRNA、tRNA、rRNA.3、核酸的理化性质：（1）一般性质：核酸的溶解度.；酸碱性；核酸的高分子性质粘度： DNA>RNA dsDNA > ssDNA；核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸 > ssDNA(或RNA) > dsDNA；核酸的化学性质：核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、烷基化等反应等。
（2）DNA的变性：DNA变性的本质是双链间氢键的断裂；（3)DNA的复性与分子杂交 : DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA 经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) ;减色效应: DNA复性时，其溶液OD260降低的现象.(4)核酸酶:核酸酶是指所有可以水解核酸的酶.(5)核酶:催化性RNA 作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA; 催化性DNA人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
遗传学(笔记)21-25
○原核染色体是褐露的DNA，染色质结构对基因的表达没有明显的调控。
真核的染色质DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体，染色质结构对基因的调控是明显的。
○原核生物中有正调控（乳糖操纵子）和负调控。
真核生物迄今已知的主要是正调控，而且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合去才能启动基因的转录。
○原核生物：转录和翻译的在同一地点同时进行的。
真核生物：转录在细胞核中进行，翻译在胞质中进行。
○真核生物：多细胞，不同细胞表达不一样。
原核生物：单细胞。
遗传工程所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。
然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞，使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。
按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。
所以基因工程也称为遗传工程、基因操作、ＤＮＡ重组技术。
有时人们还称它为基因克隆或分子克隆。
遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。
第一节基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。
限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。
这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。
Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。
•识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。
生物化工学科硕士学位研究生培养方案
生物化工学科硕士学位研究生培养方案生物化工学科硕士学位研究生培养方案（081703）一、培养目标培养为社会主义现代化建设服务，德、智、体全面发展的生物化工高层次专门人才。
具体要求：1、较好地掌握马克思列宁主义、毛泽东思想的基本原理和邓小平理论、“三个代表”重要思想；树立辩证唯物主义和历史唯物主义世界观。
2、拥护党的基本路线，热爱祖国，遵纪守法，品行端正。
具有强烈的事业心和求实创新、团结协作的精神；献身科学事业，积极为社会主义现代化建设服务。
3、掌握本学科领域内坚实的基础理论和系统的专门知识，具有从事科学研究工作或独立承担技术性工作的能力；具有较宽的知识面和较强的适应性。
4、能较熟练地掌握一门外语。
5、具有健康的体魄和良好的心理素质。
二、研究方向1、生物化学加工研究生物质资源通过生物化学加工方法制取清洁能源、酶制剂、蛋白饲料、功能性食品等的基础理论和应用开发。
2、酶工程研究微生物酶的菌种筛选、微生物酶的合成、酶学性质、酶的分离提纯、酶的应用等。
3、生化分离技术运用生物反应与生物分离的原理开发和设计生物分子分离过程、优化生物分离过程。
4、微生物基因工程重组微生物的构建和基因表达技术；木质纤维降解酶类及其相关基因的分子生物学研究。
三、学习年限和时间安排全日制硕士研究生的学习年限一般为3年。
按课程学习与论文工作并重原则，课程学习累计1-1.5学年，论文工作量不少于1学年。
根据实际情况，经本人申请、导师同意、学校批准，可适当提前或延长一年，在职硕士可延长二年。
四、课程设置、学分要求和课程说明1、课程设置和学分要求课程设置分为学位课和非学位课，总学分要求不少于32学分（其中实践性环节2学分），其中学位课程18学分，非学位课程12学分。
对于同等学力和跨学位考的硕士生需补本科生课程，其成绩可减半登记学分，不占应学32学分的总学分。
讲课20学时为1学分，实验课30学时为1学分。
选修课程由指导教师和研究生根据专业培养方向要求，以及研究生原有基础、特长及专业爱好共同商定。
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3.1.2 限制酶的发现
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❖Ⅰ型内切酶的发现
3H标记未修饰的λ 噬菌体DNA + 32P标记修饰的λ 噬菌体DNA
温育一定时间
不同菌株细胞
蔗糖梯度离心分析DNA
未修饰的DNA降解 修饰的DNA未降解 表明菌株细胞中存在核酸内切酶的活性
3.1.3 限制性内切酶的一般特点
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特性
HindIII -GGCAAGCTTACT--CCGTTCGAATGA—
--CTCGA—OH
p—AGCTTGTTC-
--CAGCTTCGA—p HO—ACAAG-
-GCA—OH
p—AGCTTACT--
-CCGTTCGA—p
HO—ATGA—
混合 退火
HO p --C T C G A A G C T T G T T C---C A G C T T C G A A C A A G—
限制修饰活性
蛋白质结构 辅助因子 识别位点 序列特异的切割
基因克隆中的用处
Ⅰ型
Ⅱ型
单一功能 三种亚基
分开的内切和甲基 活性
单一成分
ATP，Mg+2、 SAM
Mg+2
EcoB:TGA(N)8TGCT 旋转对称
距识别位点至少1000 bp 识别位点特异切割 随机切割
无用
十分有用
Ⅲ型
双功能
2种亚基 ATP，Mg+2 、 SAM EcoP1:AGACC 识别位点3’端24-26 bp 处 用处不大
第一节 限制性内切酶
3.1.1 寄主控制的限制与修饰现象（ 50年代初）
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EOP=1
E.coli C
EOP=1
EOP= 10-4
EOP=1
EOP=10-4
E.coli K
EOP=1
EPO: efficiency of plate
限制的实质是切割外源 DNA, 修饰的实质是通过甲 基化等修饰自身DNA而不 被切割 起作用的是核酸内切酶和
3.1.4 限制性内切酶的命名方式
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• 第一个字母采用含有此酶的细菌属名的第一个字 母，
• 后两个字母为种名的前两个字母，小写，株系数 字通常都省略，
• 罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出的不同 的限制性内切酶。
• 比如HpaI和HpaII就是从同一种细菌中分离出来的 第一种和第二种类型II的限制性内切酶。
P OH
图 2－10 两段粘性末端 DNA 的互补配对
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3.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素
(1)DNA的纯度 (2)DNA的甲基化程度 (3)酶切消化反应的温度 (4)DNA的分子结构 (5)核酸内切限制酶的缓冲液
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第二节 DNA、RNA连接酶
3.2.1 连接酶
待 连 接 二 端 之 一 须 有 磷 酸 根
3.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)
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三种活性，即5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的核酸外切酶活性和3’-5’的核酸 外切酶活性。3’-5’的外切活性比T4或T7聚合酶的相应活性低得多。
×
√
√
√
√
√
返回第三章
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3.3.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ K1enow片段
返回第三章
枯草杆菌蛋白酶水解大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶所得 K1enow聚合酶仍具有5’-3’的聚合酶活性、 3’-5’的核酸外切酶活性,但失去了全酶 的
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3.2.4 DNA的连接策略
一、粘性末端DNA片段的连接 二、平末端DNA片段的连接 (1)同聚物加尾法
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(2)衔接物连接法 双衔接物法
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(3)DNA接头连接法
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3.2.5．热稳定的DNA连接酶
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从嗜热高温放线茵菌株中分离纯化 能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶:在85℃高温
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被酶切开的双链DNA在端口各形成4个碱基暴露在外的单链，即形成粘性末端， 内切部位为磷酸二酯键处
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53’’……GCATTAATATGC ……53’’
53’’……GCATTA
AAC TTG
……35’’
3.1.5 同尾酶和同裂酶
AGATCT TCTAGA
CGATCG GCTAGC
下都具有连接酶的活性，而且在重复多次升温到940 ℃之后也仍然保持活性。
使用此种DNA连接酶进行体外连接，可明显降低形成非持异性连接产物的机率。 现已经能够从克隆的大肠杆菌中大量制备.
3.2.6 寡核苷酸连接测定
返回第三章
3.2.7 连接酶链式反应
也叫连接扩增反应，是应用寡核 苷酸探针通过DNA连接酶的作用 扩增已知序列的靶DNA
返回第三章
(1) 裂口连接酶链式反应 (P151) (2)不对称裂口连接酶链 式反应
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3.2.8 连接策略
1、匹配的粘性末端： ２、平末端： ３、不匹配的粘性末端：
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第三节 DNA聚合酶
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DNA聚合酶：需要模板，有多种活性，催化1个个核苷酸在链的3’接上去 Taq DNA聚合酶 ： 来自于嗜热的古细菌 逆转录酶：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成一段与mRNA互补的 DNA片段 末端核苷酸转移酶：需要模板
A GATCT TCTAG A
C
GATCG
GCTAG
C
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3.1.6 Ⅱ型酶的特点和识别位点
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•大多数II型酶结合并且切割回文序列，又称为识别序列或识别位点 •酶切后产生5’磷酸突出或3’羟基突出的末端，它们统称为粘性末端 酶 •有一些在切割两条链时会产生两端平整(平末端)的DNA分子 •酶的识别位点的可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对 •在分子克隆实验中使用最普遍的是识别4个或6个碱基对的酶 •星号活性:非最佳条件下表现出的活性
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3.2.2 常见的DNA连接酶
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大肠杆菌DNA连接酶,由细菌DNA编码，只连接 粘性末端。 T4 DNA连接酶， 由T4噬菌体侵染的大肠杆菌产生。噬菌体 DNA编码，对平末端的连接效率比细菌DNA连接酶高的多。 热稳定的DNA连接酶：嗜热高温放线菌中分离，85度有高活性， 94仍有活性。
3.1.7 类型II限制性内切酶的主要用途
1，绘制物理图谱（酶切位点图谱）
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2，产生克隆位点
两个不同的DNA样品用同一种酶酶切后，能产生相同的粘性末端 两个平末端DNA片段也可以进行相互拼接
HindIII --CTCGAAGCTTGTTC--CAGCTTCGAACAAG-