蛋白质的提取与检测

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wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言:WB蛋白提取是一种常用的实验技术,用于研究蛋白质的表达及其相互作用。

本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤,包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。

一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步,旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分,释放出目标蛋白质。

常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。

其中,最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液,通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。

二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。

在细胞裂解后,目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。

为了提取目标蛋白质,需要将裂解液进行离心,分离出上清液。

上清液中含有目标蛋白质,可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。

三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一,旨在提高目标蛋白质的浓度,便于后续的蛋白质检测。

常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。

在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值,以避免蛋白质的降解和聚集。

四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步,用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。

常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。

其中,SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法,可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带;免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合,然后使用酶标记的二抗进行检测。

总结:WB蛋白提取是一种重要的实验技术,用于研究蛋白质的表达及其相互作用。

其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。

通过合理选择和操作这些步骤,可以获得高质量的蛋白提取物,为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。

参考文献:[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。

蛋白质检测操作规程最新

蛋白质检测操作规程最新

蛋白质检测操作规程最新《蛋白质检测操作规程》一、实验室安全操作规程1. 实验室应具备必要的安全设施,如安全淋浴器,消防器材,急救箱等。

2. 操作人员应穿戴好实验室服装、手套和护目镜,并在操作过程中避免接触有害物质。

3. 实验室内禁止饮食,操作台面应保持清洁整洁,避免交叉污染。

二、蛋白质检测操作规程1. 样品准备:取得待测样品,根据要求进行样品制备,如细胞抽提、蛋白质提取等。

2. 蛋白质浓度检测:采用比色法或荧光法等方法,测定待测样品中蛋白质的浓度,并根据需求稀释样品。

3. 凝胶电泳:将待测蛋白质样品加入凝胶样品槽,进行蛋白质分离,检测蛋白质的分子量。

4. Western blot:将分离的蛋白质转移到膜上,然后用特异性抗体探测需要的蛋白质。

5. 结果分析:根据Western blot结果,判断目标蛋白质的表达情况,经过定量分析,得出相应的实验数据。

三、实验记录和报告1. 操作人员应记录实验的详细过程、使用的试剂和仪器型号、操作步骤、实验数据等内容。

2. 实验完成后,应将实验记录整理成报告,包括实验目的、原始数据、结果分析和结论等部分。

四、仪器设备维护和清洁1. 实验后及时清洁和消毒使用过的实验仪器和设备,确保下次使用前的卫生安全。

2. 定期对实验室仪器进行检查和维护,保证仪器正常使用。

五、结果存档和数据管理1. 所有实验记录和报告要有相应的存档,并按照规定的时间要求保存。

2. 实验数据的管理应该做好备份,并防止数据丢失或篡改。

通过以上《蛋白质检测操作规程》,实验室可按照规程科学、规范的开展蛋白质检测工作,确保实验数据的准确性和实验室的安全运行。

WB实验步骤详解

WB实验步骤详解

WB实验步骤详解WB实验(Western Blotting)是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。

在WB实验中,通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来,然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上,并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。

最后,使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。

下面是WB实验的详细步骤:1.提取蛋白质:首先,从细胞、组织样本中提取蛋白质。

这个步骤可以使用不同的方法,例如细胞裂解、组织切碎和离心等。

提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。

2.蛋白质电泳分离:将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合,然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。

通常使用的凝胶是SDS-(聚丙烯酰胺凝胶电泳),该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。

样品加载完毕后,通电进行电泳分离。

较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部,较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。

3.转印:将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。

通常使用的膜是聚偏氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素膜。

在转印之前,通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。

然后,将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起,将其放置在转印装置中,施加电流进行蛋白质转印。

4.阻断:将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。

阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。

最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。

5.抗体孵育:使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。

首先将抗体稀释在主抗体稀释液中,然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。

通常在4℃下过夜孵育,使抗体与目标蛋白质结合。

选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。

6.辅助抗体孵育:将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上,用于识别已结合的主抗体。

这些次级抗体通常与酶(如辣根过氧化物酶)或荧光染料标记进行共轭,以便于标记的抗体的检测。

次级抗体与主抗体结合形成复合物。

7.检测:使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。

这些方法可以使用酶标法(如辣根过氧化物酶反应和色素显色)或荧光技术(如荧光染料)。

蛋白质检测步骤

蛋白质检测步骤

蛋白质检测步骤
蛋白质检测通常包括以下几个步骤:
1. 样品制备:将待检测的样品(如细胞、组织或液体)进行样品制备处理,以提取出其中的蛋白质。

这可以通过细胞破碎、离心、溶解等方法完成。

2. 蛋白质定量:使用合适的方法(如BCA、Bradford或Lowry 法)对提取的蛋白质进行定量,以确定样品中蛋白质的浓度。

3. SDS-PAGE电泳:将蛋白质样品按照分子量大小进行分离。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法,将蛋白质在电场作用下经过凝胶,在凝胶中移动,使得不同分子量的蛋白质分离开来。

4. 转膜:将分离好的蛋白质从凝胶转移到膜上,一般是使用半导电转膜方法,例如使用尼龙膜或聚偏氟乙烯(PVDF)膜。

5. 免疫检测:将蛋白质膜进行免疫检测,以检测特定的蛋白质。

这可以通过Western blotting方法实现,即将膜与特异性抗体结合,形成免疫复合物,再利用染色或化学发光等方法进行检测。

6. 数据分析:根据实验结果进行数据分析和解释,确定目标蛋白质的表达水平、分子量等信息。

需要注意的是,蛋白质检测的具体步骤会因不同的实验目的和方法而有所差异,上述步骤仅是一般的流程,具体操作应根据实验需求进行调整。

牛奶中蛋白质的提取与鉴定

牛奶中蛋白质的提取与鉴定
深入研究牛奶中蛋白质的功能性质,如乳化、凝胶等, 为其在食品工业中的应用提供理论支持。
探索更为高效、环保的蛋白质提取方法,降低提取成本, 提高提取效率。
加强与其他学科的合作,如生物学、医学等,从多角度 探究牛奶中蛋白质的作用和价值。
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分离。
纯化原理
分子筛原理
利用不同大小的蛋白质分子在通过分子筛时受到不同程度的阻拦, 从而实现分离。
亲和层析法
利用蛋白质与配体之间的特异性亲和力,将目标蛋白质与其他蛋 白质分离。
离子交换层析法
利用不同蛋白质分子所带电荷性质的差异,通过离子交换剂进行 分离。
实验材料与设备
实验材料
牛奶、缓冲液、离子交换剂、亲和配 体等。
实验设备
离心机、电泳仪、层析柱、pH计、天 平等。
04 蛋白质的鉴定
鉴定方法
化学分析法
通过蛋白质的化学性质进行鉴定,如测定氮 含量、氨基酸组成等。
色谱技术
利用不同蛋白质在色谱柱上的吸附或洗脱性 质进行分离和鉴定。
免疫学方法
利用抗原-抗体反应原理,通过特异性抗体 对蛋白质进行检测。
质谱技术
通过蛋白质的质荷比进行分离和鉴定,常用 于蛋白质的序列分析和结构研究。
02 牛奶中蛋白质的提取
提取方法
01
02
03
离心法
利用高速离心机将牛奶中 的蛋白质与其他成分分离, 收集离心后的沉淀物即可 得到蛋白质。
沉淀法
通过加入适量的盐或有机 溶剂,使蛋白质沉淀,再 经过过滤和洗涤,得到纯 净的蛋白质。
膜过滤法
利用孔径大小不同的膜, 将牛奶中的蛋白质和其他 小分子物质分离,得到高 纯度的蛋白质。
提取原理

wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB(Western Blot)蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法,通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测,可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。

本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。

二、样品准备1. 收集样品:根据研究目的,选择合适的样品进行提取。

样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。

2. 样品处理:对于细胞和组织样品,可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。

对于血清样品,可离心去除悬浮的细胞或血小板。

三、蛋白提取1. 细胞裂解:将细胞沉淀离心后,加入细胞裂解液,使细胞膜破裂释放蛋白质。

可以选择不同的细胞裂解液,如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。

2. 组织裂解:将组织样品切碎后,加入组织裂解液,将组织细胞破碎并释放蛋白质。

组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。

3. 蛋白质提取:将裂解液离心,收集上清液,即为蛋白提取物。

可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。

四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳:将蛋白样品加热变性,然后加载到凝胶孔中,施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。

常用的凝胶浓度为8%~15%。

2. 转膜:将凝胶中的蛋白质转移到膜上,常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。

常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。

3. 阻断与孵育:将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育,阻断非特异性结合位点,避免假阳性结果的产生。

4. 一抗和二抗孵育:将目标蛋白特异性抗体(一抗)孵育于膜上,然后孵育与一抗结合的二抗,二抗中带有标记物,例如辣根过氧化物酶(HRP)等。

5. 显色与成像:使用化学发光法或染色法,使膜上特定蛋白质形成显色带,然后使用成像系统进行成像和分析。

五、结果分析通过观察显色带的位置和强度,可以初步判断蛋白质的表达水平。

根据需要可以进行定量分析,使用专业软件测量带的强度,并与内参蛋白进行比较分析。

六、注意事项1. 样品保存:样品提取后应及时保存,避免蛋白质降解。

食品中蛋白质的检测方法

食品中蛋白质的检测方法

食品中蛋白质的检测方法
蛋白质作为人体生命活动的基础,是细胞构成和功能维持的重要组成部分。

在食品安全和营养评估中,对食品中蛋白质的检测显得尤为重要。

本文将介绍几种常用的食品中蛋白质检测方法。

一、生物化学方法
1. 琼脂糖凝胶电泳法:将待测食品样品提取出蛋白质后,通过琼脂糖凝胶电泳分离蛋白质,根据蛋白质的迁移速度和分子量来判断食品中蛋白质的种类和含量。

2. 比色法:利用食品中蛋白质与某些试剂发生化学反应,形成有色产物,通过比色计测定产物的光吸收值,进而确定食品中蛋白质的含量。

二、免疫学方法
1. 酶联免疫吸附测定法(ELISA):该方法利用特异性抗体与食品中蛋白质结合,再通过酶标记的二抗、底物和显色剂等反应,测定产生的光信号强度来确定食品中蛋白质的含量。

2. 免疫电泳法:将食品中蛋白质与特异性抗体反应后,经过电泳分离,再利用酶标记的二抗进行检测,通过测定产生的酶活性来确定食品中蛋白质的含量。

三、分子生物学方法
1. 聚合酶链式反应(PCR):该方法利用特异性引物扩增目标蛋白质的DNA序列,进而通过测定扩增产物的数量来确定食品中蛋白质的含量。

2. 荧光定量PCR:通过引入荧光标记的探针,利用PCR扩增产物的特异性结合,测定荧光信号的强度,从而确定食品中蛋白质的含量。

食品中蛋白质的检测方法多种多样,选择合适的方法可以准确快速地确定食品中蛋白质的含量。

在实际应用中,我们可以根据实验需求和条件选择适合的方法,以保证食品安全和营养评估的准确性。

蛋白质鉴定的过程和原理

蛋白质鉴定的过程和原理

蛋白质鉴定的过程和原理
蛋白质鉴定是通过一系列实验步骤和技术来确定蛋白质的存在、特性和相互作用的过程。

下面是蛋白质鉴定的一般过程和原理:
1. 样品准备:首先,需要从细胞或组织中提取蛋白质。

这可以通过裂解细胞膜和细胞核膜,然后用不同的提取溶液来获得含有蛋白质的提取液。

2. 蛋白质分离:得到的蛋白质混合物会经过分离步骤,以将不同的蛋白质分离开来。

常用的蛋白质分离方法包括凝胶电泳(如SDS-PAGE)和液相色谱(如高效液相色谱)。

3. 蛋白质定量:确定蛋白质的浓度是后续实验的重要步骤。

这可以通过比色法、光谱法或免疫测定等方法来完成。

4. 免疫检测:使用特定抗体可在样品中检测到特定的蛋白质。

免疫检测可以通过免疫印迹(Western blot)、免疫组化染色、酶联免疫吸附测定等方式进行。

5. 二维电泳:该技术用于更好地分离和鉴定复杂的蛋白质混合物。

它结合了等电聚焦和SDS-PAGE两种分离方法,可以分离具有不同等电点和分子量的蛋白质。

6. 质谱分析:质谱分析可提供蛋白质的精确定量和结构信息。

常用的质谱方法
包括质谱光谱法(如MALDI-TOF)和液相质谱法(如液相色谱-串联质谱法)。

7. 数据分析:通过对蛋白质鉴定实验得到的数据进行处理和分析,可以鉴定蛋白质的序列、结构和相互作用等特性。

这些步骤和技术的选择取决于研究者的需求和具体的蛋白质鉴定目标。

综合运用这些方法可以对蛋白质进行准确的鉴定和表征。

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蛋白质的提取与检测蛋白质的提取与检测第一节细胞总蛋白的提取及含量测定【基本原理】蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。

目前常用的有四种经典的方法,即定氮法、双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。

另外还有两种近年普遍使用起来的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)与二辛可宁酸法(BCA法)。

值得注意的是,上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。

每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。

在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。

Lowry法:蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展,从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色,在750nm有最大光吸收值。

在一定浓度范围内,反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同,因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。

Bradford法:蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合,使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm,溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。

在一定的线性范围内,反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比,测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。

BCA (Bicinchoninicacid)法:二价铜离子在碱性的条件下,可以被蛋白质还原成一价铜离子(Biuretreaction)并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。

两分子的BCA螯合一个铜离子,形成紫色的反应复合物。

该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性,吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关0.118 0.050.154 0.10.213 0.20.283 0.30.329 0.40.404 0.5第二节SDS-PAGE电泳【基本原理】SDS-PAGE电泳技术(SDS polyacrylamede gel electrophoresis)首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。

当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后,则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,其它因素可以忽略不计。

SDS是一种阴离子去污剂,它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键(氢键和疏水键)。

在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的存在下,蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。

解聚后的蛋白质分子或其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异,蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。

椭圆棒的短轴对不同的蛋白质-SDS复合物基本上是相同的,但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比,因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小。

当蛋白质的分子量在15~200kD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

因此,SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质,而且可以根据迁移率大小测定蛋白质的分子量。

【试剂配制】1.10%SDS:10g SDS加入100ml去离子水中,50℃水浴下溶解,室温保存。

2. 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8):Tris-base 45.43g,加入200ml去离子水溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,加去离子水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。

3. 1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8):Tris-base 30.29g,加入200ml去离子溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,加去离子水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。

4.电泳缓冲液:Tris-base 3.03g,Glycine 18.77g,SDS 1g,加入适量去离子水溶解后定容至1L,室温保存。

5.5×Loading buffer:50%甘油,250 mM Tris-HCl(pH6.8),10% β-巯基乙醇,2.5‰溴酚蓝,10% SDS。

混匀后,分装于1.5ml离心管中,4℃保存。

6.10%过硫酸胺(AP):0.1g过硫酸胺溶解于1.0ml去离子水,4℃保存,保存时间为2周。

7.四甲基乙二胺(TEMED):分装少量原液于棕色瓶,4℃避光保存。

8.30% Acr/Bic(37.5:1):丙烯酰胺(Acr)29.2g,甲叉双丙烯酰胺(Bic)0.8g,加入适量去离子水于37℃下充分溶解并定容至100ml,4℃保存。

注意:Acr/Bic均具有毒性,易吸附和积累,应戴手套进行操作。

9.凝胶脱色液:500ml乙醇,100ml冰醋酸,加去离子水定容至1L,室温保存。

10.考马斯亮蓝G250蛋白染色液:0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中,混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质,置于棕色瓶中室温保存。

11.凝胶保存液:450ml脱色液中加入50ml甘油,混匀后室温保存。

12.SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)配方:13.分离胶配方【操作步骤】一、凝胶的配制与电泳(1)凝胶配制与上样1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2.配制10%浓度的分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生,待灌入2/3的分离胶后应立即封胶,用水饱和的异丁醇或异戊醇,也可以用0.1%的SDS。

3.胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4.配制5%浓度的浓缩胶,将剩余空间灌满后立即将梳子插入浓缩胶中;插梳子时要使梳子保持水平,浓缩胶凝固的过程中要补胶1~2次。

5.待到浓缩胶凝固后,竖直向上轻轻拔出梳子,用水冲洗一下浓缩胶,将其放入加有电泳缓冲液的电泳槽中。

6.取出含50μg蛋白样品与5×Loading buffer按比例充分混合,煮沸5min。

7.加足够的电泳液后用微量加样器贴壁上样,注意不要吸进气泡。

(2)电泳1.以初始电压为80V进行电泳, 30min,样品进入分离胶后改为120~150V。

2.在溴酚兰泳动至距胶下缘约1cm时即可终止电泳(目的蛋白条带一般跑过分离胶的1/3,可根据预染蛋白Marker调整电泳时间)。

二、考马斯亮蓝染色1.电泳后的凝胶于染色液中振荡染色4h或40℃染色1h,然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次。

2.多次变换脱色液直至凝胶背景脱净为止,为加快脱色,可略加温度。

3.凝胶保存:脱去背景色的凝胶在保存液中浸泡30min,然后将凝胶放在玻璃板上,用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下干燥即可。

第三节免疫印迹(Western Blot)【基本原理】Western Blot中文一般称为蛋白质免疫印迹,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色、化学发光或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【试剂配制】1.电转液:Tris-base 5.8g,Glycine2.9g,SDS 0.37g,甲醇200 ml,去离子水定容至1L,室温保存。

2.TBS:20mM Tris-HCl (pH7.4),150mM NaCl,室温保存;3.TBST:即含0.05% Tween20的TBS缓冲液。

4.封闭液与抗体稀释液:均为含5%脱脂奶粉的TBST,溶解后4℃保存。

【操作步骤】一、转膜1.将PVDF膜在甲醇中浸泡3min,完全浸湿后置于入转膜液中。

2.将胶平铺于海绵上,按图示顺序铺上膜与每侧1~2张滤纸,注意用玻璃棒逐出气泡,剪去滤纸与膜的过多部分。

从负极(黑色板)依次铺海绵-滤纸(3层)-胶-PVDF膜-滤纸(3层)。

3.将夹子放入转移槽中,要使夹子的黑面对转移槽的黑面,夹的白面对红面。

4.将转移槽置于冰水混合物中,300mA,1.5h(同时放入冰袋,外面包冰)。

5.以预染蛋白Marker观察转移效果。

注意:①转移液含甲醇,操作时要戴手套;②整个操作均在转移液中进行,要不断的擀去气泡;③膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路;④注意转膜时电极方向是“膜正胶负”。

二、免疫反应1.封闭:将PVDF膜从电转槽中取出,去离子水与TBST稍加漂洗,浸没于封闭液(脱脂奶粉5%)中缓慢摇荡2h。

传统上有两种封闭液:脱脂奶粉或BSA,脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白(因脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白),使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。

某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号。

2.结合一抗:将β-Actin一抗(兔抗人、鼠)用封闭液稀释至适当浓度(1:2000),室温下作用2h或4℃过夜。

3.洗涤:TBST漂洗PVDF膜后再浸洗三次,每次5~10 min。

4.结合二抗:按适当比例(1:5000)稀释HRP标记的二抗(羊抗兔),室温作用2h。

5.洗涤:TBST漂洗膜后再浸洗2次,每次5~10 min。

二、DAB显色(按产品说明书操作)二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)是过氧化物酶HRP (Peroxidase)的生色底物,在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累,形成棕褐色不溶性产物。

用于检测过氧化物酶的活性,灵敏度高,特异性好。

其适用于蛋白质杂交和免疫化学,以及原位杂交染色等。

将配好的DAB直接滴加在目的片段位置,避光显色至蛋白目的条带明显出现。

将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

发光鉴定Western blot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。

碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗原(WB)监测和核酸检测。

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