PCR原理及特点--检验科
pcr的原理特点及应用领域
PCR的原理特点及应用领域1. PCR的原理特点PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA的技术，它能够迅速扩增特定DNA片段，其原理特点如下：•热循环反应：PCR是通过不断的循环变温来实现DNA的复制。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤用高温将DNA双链分离；退火步骤利用低温将引物与目标DNA序列结合；延伸步骤利用酶（如Taq聚合酶）在合适的温度下合成新的DNA链。
•引物的设计：PCR需要两个引物，它们分别位于目标DNA序列的两端。
引物的设计需要考虑到引物长度、碱基组成、GC含量和引物之间的互补性，以确保引物能够特异性地结合目标序列。
•热稳定酶的应用：PCR中最常用的DNA聚合酶是热稳定的Taq聚合酶。
由于Taq聚合酶能在高温下稳定活性，因此PCR反应可以在高温下进行，提高了反应的效率和特异性。
•指数级扩增：PCR是一种指数级扩增技术，每个PCR循环通过扩增目标DNA序列的两倍。
经过多轮循环后，可以获得大量的目标DNA。
2. PCR的应用领域PCR技术的高效、敏感和特异性使其在许多领域得到广泛应用。
以下是PCR在不同领域的应用：2.1 医学诊断PCR在医学诊断中的应用主要体现在以下几个方面：•遗传病的诊断：PCR可以用于检测基因突变，从而早期诊断遗传疾病。
例如，基于PCR的突变检测技术已经成为婴儿先天性代谢病和遗传性肿瘤等疾病的常规检测方法。
•传染病的诊断：PCR可以通过检测病原体的核酸来诊断传染病。
例如，PCR技术可以用于快速检测流感病毒、艾滋病病毒和结核分枝杆菌等病原体。
•肿瘤标志物的检测：PCR可以用于检测肿瘤标志物的存在，从而帮助早期发现肿瘤和评估治疗效果。
2.2 基因组学研究PCR在基因组学研究中的应用主要包括：•基因克隆：PCR可以用于克隆特定DNA片段，从而进行基因功能研究。
例如，通过PCR扩增目标基因的编码区域，可以构建基因的表达载体。
•基因变异分析：PCR可以用于检测基因的变异，从而研究基因突变与疾病之间的关系。
PCR原理及特点--检验科
二温度点法 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）， 将退 火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃ 左右退火与延伸
① 变性温度与时间 • 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的 最主要原因 • 一般93℃～94℃ 1min足以使模板DNA变性
– 若低于93℃则需延长时间
– 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影 响。
复 温
复 性
低温下，引物与模板 DNA互补区结 合（55℃，30s）
3.延伸(extension) ：
中温延伸。 DNA聚合酶催化以引物 为 起 始 点 的 DNA 链 延 伸 反 应 （70～72℃，30～60s）。
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。 反应最终的DNA 扩增量的计算： Y＝(1＋X)n
在一般的 PCR反应中，dNTP浓度为200µmol/L 时，Mg2+浓度为1.5循环次数
1.温度与时间的设置 变性-退火-延伸三个温度点 标 准 反 应 中 采 用 三 温 度 点 法 ， 双 链 DNA 在 90 ～ 95℃ 变性，再迅速冷却至 40 ～ 60℃ ，引物退火并 结合到靶序列上，然后快速升温至 70 ～ 75℃ ，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸
温度与时间的设置变性退火延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法双链dna在9095变性再迅速冷却至4060引物退火并结合到靶序列上然后快速升温至7075在taqdna聚合酶的作用下使引物链沿模板延伸二温度点法对于较短靶基因长度为100300bp时火与延伸温度合二为一一般采用94变性65左右退火与延伸变性温度低解链不完全是导致pcr失败的最主要原因一般93941min足以使模板dna变性此步若不能使靶基因模板或pcr产物完全变性就会导致pcr失败变性后温度快速冷却至4060可使引物和模板发生结合
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA片段的技术，由Kary Mullis在1983年发明。
自那时以来，这项技术已成为分子生物学、遗传学、医学和法医学等领域的基础工具。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的原理是利用DNA聚合酶对DNA进行复制的过程。
通过循环加热和冷却的过程，将目标DNA序列扩增到数百万份甚至数十亿份。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
二、PCR所需材料与设备1. 材料：模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。
2. 设备：PCR仪（热循环器）、离心机、电泳设备、凝胶成像系统等。
三、PCR反应体系的建立一个标准的PCR反应体系通常包含以下成分：- 模板DNA：10-100 ng- 正向引物和反向引物：各0.5-2 μM- dNTPs：每种200 μM- 缓冲液：1X- Taq DNA聚合酶：1.5-2 U- 无菌水：补足至总体积20-50 μL四、PCR反应条件设置1. 变性：94℃，1-3分钟2. 退火：根据引物Tm值设定，一般为55-65℃，持续时间15-30秒3. 延伸：72℃，持续时间1-2分钟4. 循环次数：通常为25-35次五、PCR产物分析1. 凝胶电泳：是最常用的PCR产物分析方法，可以直观地观察PCR产物的大小和数量。
2. 克隆和测序：对于需要进一步研究的PCR产物，可以通过克隆和测序来确定其精确序列。
六、PCR的应用1. 遗传病诊断：如地中海贫血、囊性纤维化等遗传病的基因诊断。
2. 法医鉴定：如亲子鉴定、个体识别等。
3. 病原体检测：如HIV、乙肝病毒、新冠病毒等的检测。
4. 肿瘤基因检测：如BRCA1/2突变的检测。
5. 生物科技研究：如基因克隆、基因表达分析等。
七、PCR实验常见问题及解决办法1. 无扩增产物：可能的原因有模板质量差、引物设计不合理、PCR条件不合适等。
可通过优化模板提取、重新设计引物或调整PCR条件来解决。
PCR技术的原理与应用
PCR技术的原理与应用PCR（聚合酶链反应）是一种分子生物学技术，其原理是通过反复循环的DNA扩增过程将特定的DNA序列扩增至大量，从而能够在短时间内快速复制出特定的DNA片段。
PCR技术具有高度敏感性、高选择性和高效性的特点，被广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪学鉴定等领域。
第一步是变性，在高温下（通常为94-98°C），将加热的DNA双链分离成两条模板链，形成单链DNA。
第二步是退火，降低温度使引物（特异性序列）与单链DNA的末端结合。
引物主要由两条DNA寡核苷酸组成，其中一条与待扩增的DNA序列的正向链完全互补，另一条与反向链完全互补。
引物结合后，会在DNA链上形成一个引物-模板复合物，这个过程通常需要较低的温度（通常为50-60°C）。
第三步是延伸，提高温度(通常为72°C)，引物上的酶（聚合酶）会在复合物上开始从引物的3'端启动DNA合成。
聚合酶在复制过程中加入新的核苷酸，使DNA链延长。
这个过程一直持续到达到DNA链的末端，形成两个完全互补的DNA片段。
然后，变性、退火和延伸这三个步骤会循环进行多次，使扩增产物呈指数级增加，从而扩增出特定的DNA片段。
1.基因工程和分子生物学研究：PCR技术可以用于合成DNA序列，构建重组DNA、基因组测序等。
通过与其他技术的结合，如限制性内切酶切割、DNA连接、酶切酶浸出等，可以构建表达载体、突变体、基因敲除等，进一步研究基因功能和调控机制。
2.临床诊断：PCR技术可以用于检测和鉴定病原体的DNA，例如病毒、细菌和寄生虫等。
通过扩增目标DNA序列，可以快速、灵敏地检测感染性疾病，如HIV感染、结核病、肺炎等。
此外，PCR技术还可以用于肿瘤标记基因的检测、身份鉴定等医学领域。
3.古生物学研究：PCR技术可用于从古代DNA中扩增目标DNA序列，从而恢复古代生物的遗传信息。
通过对古代DNA的研究，可以获得有关过去物种和群体结构演化的重要信息。
pcr的原理特点及主要应用
PCR的原理特点及主要应用1. PCR介绍聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种能够在体外扩增DNA片段的技术。
PCR技术的发明对于基因工程、医学诊断、犯罪学分析等领域具有重要意义。
PCR通过在体外重复进行DNA的复制，能够从极少量的DNA样本中扩增出大量的特定DNA序列。
PCR技术的发明者是美国生物学家库里斯（Kary B.Mullis)，他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
2. PCR的原理PCR的原理基于DNA的双链结构和DNA聚合酶的酶活性。
PCR反应由三个关键步骤组成，分别是变性（denaturation）、引物结合（annealing）和扩增（extension）。
2.1 变性（Denaturation）在PCR反应开始时，DNA样本会被暴露在高温（通常为94到98摄氏度）下，这样DNA的双链结构会解开，形成两条单链。
这个过程被称为变性或解链。
变性的过程使DNA的两条链完全分离，暴露出待扩增的特定区域。
2.2 引物结合（Annealing）在引物结合步骤中，使用两段长度约为20到30个碱基的DNA引物。
引物是与待扩增区域的两端互补的DNA片段。
引物通过碱基配对与模板DNA的单链区域结合，形成引物-模板DNA复合物。
2.3 扩增（Extension）在扩增步骤中，将引物复合物置于较低的温度（通常为50到72摄氏度），使DNA聚合酶能够结合在引物的3’端开始向引物的5’端延伸合成新的DNA链。
这个步骤是PCR反应中最重要的步骤，因为它产生了扩增的DNA产物。
每个PCR循环都会产生两倍的DNA量。
多次循环后，DNA的数量呈指数增加。
3. PCR的特点3.1 高度灵敏性PCR技术是一种高度灵敏的方法，可以从微量的DNA样本中扩增出足够的DNA量用于进一步的分析。
这使得PCR成为一种非常有用的检测和诊断工具。
3.2 高度选择性通过选择特定的引物，PCR可以只扩增特定的DNA序列。
检验科PCR室作业指导书
检验科PCR室作业指导书一、背景介绍PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基因扩增技术，是在无需使用活性细胞的情况下通过体外扩增DNA序列，使其达到可检测的水平。
PCR技术被广泛应用于医药研究、生物学、遗传学、法医学等领域。
PCR室是PCR技术应用的关键场所，主要用于PCR反应、样品前处理和DNA制备等工作。
PCR反应是由特定的酶催化模板DNA的复制，在PCR实验中必须严格控制PCR反应的条件才能获得可靠的结果。
为了保证PCR反应结果的准确性和可靠性，PCR作业人员必须了解PCR室的操作规程和指导手册，遵守标准实验室操作程序。
二、 PCR反应的基本原理PCR反应是通过体外扩增DNA序列的一种技术。
PCR反应主要涉及两个重要的酶，即DNA聚合酶和引物。
DNA聚合酶是催化DNA聚合反应的核心酶，在PCR反应中必不可少。
引物是一种短的DNA或RNA分子，在PCR反应中用于酶的选择性识别和复制。
PCR反应主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性：将目标DNA加热到94℃的高温，使其断裂成两条单链DNA，并使引物和单链DNA互相结合。
退火：将温度降低到50-60℃，使引物与目标DNA结合，这个温度称为退火温度。
延伸：将温度升高至72℃，此时引物与DNA被催化成链延伸，成为双链DNA。
PCR反应重复进行以上步骤几个周期，就可以得到足够多的DNA扩增产物。
三、 PCR室操作规程1. 实验前准备(1)检查PCR实验室设备和试剂，检查是否缺少必要试剂和器具，并确认其备份。
(2)将外部样品进入PCR实验室前进行一定的处理，如冻存、粉碎等。
(3)制作引物工作应该在正式实验之前进行，并对其进行信号静电荷、目标大小、引物配对和特异性等核酸相关参数测试，确保可靠和有效。
制备引物的地点和PCR反应室应分开操作，单独使用平台和器具。
(4)戴上防护手套、口罩、帽子等个人防护设备，穿戴实验室制定的实验服。
pcr的原理及应用实验报告总结
PCR的原理及应用实验报告总结引言聚合酶链反应（PCR）是一种在生物学实验中广泛使用的技术，可以扩增特定DNA 序列。
本实验报告总结了PCR的原理和应用。
原理PCR利用了DNA的双链结构和DNA聚合酶的催化活性。
它通过反复进行一系列温度变化的循环，以在每个循环中将DNA的目标区域复制数百万次。
PCR的原理主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：在高温下（通常为94-98°C），通过打破DNA的双链结构，使其变成两条单链DNA。
这是通过提供足够的热能来克服DNA的氢键和茎-环结构来实现的。
2.退火（Annealing）：在较低温度（通常为50-65°C），引入一组匹配目标序列的两个DNA引物。
这些引物是短DNA片段，其序列与需要扩增的目标序列的两端相互补充。
引物结合到DNA上，形成稳定的引物-目标复合物。
3.延伸（Extension）：在适宜的温度（通常为68-72°C），DNA聚合酶开始在目标序列的引物上合成新的DNA链。
这意味着引物作为DNA聚合酶的起始点，延伸形成一条新的DNA链。
通过多次循环这个过程，从而可以扩增DNA的目标区域，从而得到大量的特定DNA序列。
应用PCR技术在许多生物学领域中都有广泛的应用。
下面介绍PCR在基因分型、病原体检测和基因工程等方面的应用。
基因分型PCR可以用于基因分型，例如DNA指纹图谱的生成和遗传病等基因突变的检测。
通过扩增特定的基因区域，可以获得个体之间的DNA差异，以区分个体之间的遗传差异。
病原体检测PCR可以用于病原体的快速检测。
通过扩增特定的病原体DNA或RNA序列，PCR 可以确定患者是否感染了病原体。
此外，PCR还可以在医学实验室中用于鉴定和检测病原体的抗药性。
基因工程PCR在基因工程中有重要的应用。
PCR可以扩增特定的基因片段，从而提供了DNA 重组的材料。
这些扩增片段可以用于构建基因表达载体、制备基因库以及进行定点突变等。
简述pcr的原理特点及主要应用
简述PCR的原理、特点及主要应用1. PCR的原理PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的技术，通过核酸酶的反应周期性产生的大量DNA分子，从而实现对特定DNA片段的扩增。
PCR的原理主要包括以下几个步骤：•Denaturation（变性）：将DNA样本加热至95°C，使双链DNA变为单链。
•Annealing（退火）：将温度降至50-60°C，使引物与DNA模板序列结合。
•Extension（延伸）：将温度升至72°C，加入DNA聚合酶和碱基，合成新的DNA链。
•重复Denaturation、Annealing和Extension步骤，每次循环会使DNA数量翻倍。
通过多次循环，可以在短时间内扩增特定的DNA序列。
2. PCR的特点PCR具有许多独特的特点，使其成为现代分子生物学和遗传学研究的重要工具：•高度特异性：引物序列能够选择性地与目标DNA序列结合，减少非特异性扩增的可能性。
•高度灵敏性：PCR可以从极小的DNA样本中扩增特定序列，使其可用于DNA检测和分析。
•快速和高效：PCR反应时间短，扩增速度快，能够在几小时内扩增数百万个目标DNA分子。
•可靠性和重复性：PCR结果的可靠性高，重复性好，可以精确地扩增特定的DNA序列。
•多样性和灵活性：PCR可以用于不同类型的DNA样本，包括基因组DNA、RNA、血液、组织等。
3. PCR的主要应用由于PCR技术的独特优势，它在许多领域得到广泛应用，主要包括以下几个方面：3.1 分子诊断和疾病检测PCR可以用于检测和诊断许多疾病，包括感染病、癌症和遗传病等。
它能够从患者的体液、组织或细胞中扩增特定的病原体DNA或突变基因，为病理诊断和个体化治疗提供重要信息。
3.2 法医学和人类遗传学PCR被广泛应用于法医学和人类遗传学的研究中。
它可以用于DNA指纹鉴定，确定个人的身份或亲子关系。
此外，PCR还可以用于检测遗传病变、进行基因组学研究以及解决亲子关系和家族血统等问题。
医院检验科PCR实验室特点及功能
区域划分明确
实验室区域的划分原则
区域划分的意义
PCR实验室通常划分为试剂准备 区、标本制备区、PCR扩增区和 产物分析区等独立工作区域，各 区域之间设有物理隔离和缓冲间， 以确保实验流程的有序进行。
明确的区域划分有助于防止交叉 污染，保证实验结果的准确性， 同时也为实验室管理提供了便利。
PCR实验室功能
人员培训
安全知识与技能培训 实验人员需接受生物安全、消防安全、 水电安全等方面的培训，并定期进行考 核。
专业技能提升
实验室应鼓励技术人员参加专业培训，提 升其专业技能和实验水平。
准入制度
门禁系统的设立 实验室应建立准入制度，设立密码识别的门禁系统，并张贴警示标示。
人员管理措施 实验室应制定严格的人员管理措施，确保只有授权人员才能进入实验室工作区域。
医院检验科PCR实验 室特点及功能
目录
01 PCR实验室概述 02 PCR实验室特点
03 PCR实验室功能
04 PCR实验室资质与生物安全要求
05 人员管理与准入制度
06 PCR实验室的未来发展
PCR实验室概述
PCR技术简介
PCR技术的原理 聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，通过模拟DNA复制的过 程，在短时间内扩增特定的DNA片段。该技术基于DNA模板、引物、酶和 缓冲液等反应物，在三个主要步骤——变性、退火和延伸——的循环中， 实现目标DNA片段的指数级增长。
快速高效
01
实验流程的优化 随着技术的进步，PCR实验流程得 到了极大的优化，从样本准备到结 果分析通常只需要数小时，大大提
高了检测效率。
02
快速检测的优势
快速高效的检测为临床提供了及时 的诊断结果，对于急性疾病的救治
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标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至 10µl 各200µmol/L 10～100pmol 0.1～2µg 2.5u 1.5mmol/L 100µl
PCR反应五要素
1. 引物（primer）
2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模板 （template） 5. Mg2+ （magnesium）
PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值 及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之 酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 (简称 Taq polymerase), 则是于1976年从热泉 Hot spring中 的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。 PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication)，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单 纯且短暂性基因复制 (类似PCR前两个周期反应) 的实验。 而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的， Dr. Mullis当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很 大的巿场。Dr.Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质 量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年， Science 将 PCR 中的 DNA 合成酵素命名为当年的风云分子 (Molecule of the year)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。
• 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变 性，就会导致PCR失败
② 退火(复性)温度与时间
• 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素； • 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和 模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多， 引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互 补链之间的碰撞；
复 温
复 性
低温下，引物与模板 DNA互补区结 合（55℃，30s）
3.延伸(extension) ：
中温延伸。 DNA聚合酶催化以引物 为 起 始 点 的 DNA 链 延 伸 反 应 （70～72℃，30～60s）。
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。 反应最终的DNA 扩增量的计算： Y＝(1＋X)n
目
录
PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应五要素 PCR的反应条件的选择 PCR的应用
PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70 年代初人们致力于研究基因的体外分离技术， Korana 于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸 引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
• 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板 之间完全结合
③ 延伸温度与时间： • 延伸温度：一般选择在70～75℃之间
– 常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物 和模板的结合。高于90℃时，DNA合成几乎 不能进行
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定
– 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10Kb需延伸至15min
二温度点法 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）， 将退 火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃ 左右退火与延伸
① 变性温度与时间 • 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的 最主要原因 • 一般93℃～94℃ 1min足以使模板DNA变性
– 若低于93℃则需延长时间
– 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影 响。
PCR的改进与完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的 Klenow片段，其 缺点是： ①Klenow 酶不耐高温，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一
次酶只能完成一个扩增反应周期，给 PCR 技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的 特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。 理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计的原则
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的 嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互 补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶 切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；
• 延伸进间过长会导致非特异性扩增，对低 浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
2.循环次数
决定PCR扩增程度; 主要取决于模板DNA的浓度; 选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性 产物的量亦随之增多
PCR反应特点
• • • •
特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低
1.特异性强
• 关键：引物与模板的正确结合 • 引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对 原则的 • 合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性， 使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的 温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶 基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特 异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高
临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原 体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用 于PCR扩增； RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止 RNase降解RNA
5.Mg2+浓度
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异 性和产量有显著的影响;
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出Байду номын сангаас非特异 扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性， 使反应产物减少。
概念
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction， PCR ）是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退 火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互 补的子链 DNA 的过程。是一项 DNA 体外合成放 大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控， 基因多态性研究等许多方面。
在一般的 PCR反应中，dNTP浓度为200µmol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜;
PCR反应条件的选择 温度 / 时间 / 循环次数
1.温度与时间的设置 变性-退火-延伸三个温度点 标 准 反 应 中 采 用 三 温 度 点 法 ， 双 链 DNA 在 90 ～ 95℃ 变性，再迅速冷却至 40 ～ 60℃ ，引物退火并 结合到靶序列上，然后快速升温至 70 ～ 75℃ ，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸
2.酶及其浓度
目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反 应体积为100µl时）； 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合 成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系： dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是 注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或 偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率 达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物 的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性 增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。 大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR技术的基本原理
类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依 赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤 构成：
加热
变 性
1.变性(denaturation) ：：
高 温 使 双 链 DNA 解 离 形 成 单 链 （94℃，30s）