焦磷酸测序用于COL1A1基因多态性与骨肉瘤易感性关系分析
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
焦磷酸测序技术检测SLCO1B1基因多态性方法的建立
焦磷酸测序技术检测SLCO1B1基因多态性方法的建立万子睿;谢海棠;郭栋;胡东莉;王丽萍;王果【期刊名称】《中国临床药理学与治疗学》【年(卷),期】2012(17)5【摘要】目的:建立SLCO1B1A388G和T521C单核苷酸多态位点的焦磷酸测序方法,分析中国健康人群中分布频率。
方法:制备300例健康人外周血gDNA,应用PyroMark ID焦磷酸测序仪进行多态位点分型分析。
并通过重复性检验和毛细管电泳测序验证方法正确性。
结果:建立了SL-CO1B1A388G和T521C多态性分析的焦磷酸测序新方法,经毛细管电泳测序验证和重复性验证,结果准确可靠。
在300例标本中,388A、388G、521T、521C等位基因频率分别为28%、72%、89.5%和10.5%,符合Hardy-Weinberg平衡。
结论:焦磷酸测序方法可准确、高通量、快速检测SLCO1B1A388G和T521C单核苷酸多态性,特别适宜大样本量的临床及科研批量检测需要。
【总页数】6页(P543-548)【关键词】焦磷酸测序;SLCO1B1;OATP1B1;单核苷酸多态性【作者】万子睿;谢海棠;郭栋;胡东莉;王丽萍;王果【作者单位】中南大学临床药理研究所;皖南医学院弋矶山医院临床药学部安徽省药物临床评价中心【正文语种】中文【中图分类】R968【相关文献】1.焦磷酸测序技术检测细胞色素2D6*10基因多态性方法的建立 [J], 丁媛媛;赵钢涛;杨凡;许景峰2.焦磷酸测序检测CYP2C19基因多态性方法的建立 [J], 杨楠楠;徐琴;罗振元;付雪;黄盛文3.焦磷酸测序技术快速测定肾移植受体人群CYP3A5*3基因多态性方法的建立 [J], 朱利军;周宏灏;李定云;李智;叶启发;王果;明英姿;成柯;赵于军;佘兴国4.焦磷酸测序检测载脂蛋白E基因多态性方法的建立 [J], 初亚男;封利颖;吴燕子;张婕妤5.焦磷酸测序技术检测LAMA5 rs944895基因多态性方法的建立 [J], 贾政军;王华;彭向京;黄定梅;王果因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
基于高通量测序分析骨肉瘤发生和转移的分子特征
基于高通量测序分析骨肉瘤发生和转移的分子特征许明贤;李瑞希;郭伟堂;程鸣哲;邹昌业【期刊名称】《中山大学学报:医学科学版》【年(卷),期】2022(43)6【摘要】【目的】本研究通过第二代高通量测序(NGS)检测配对骨肉瘤转移灶和原发灶标本,分析骨肉瘤原发灶与转移灶的基因图谱差异,以期发现促进骨肉瘤发生和转移的相关分子及可能机制。
【方法】12例转移患者的原发灶与转移病灶肿瘤组织样本,使用第二代高通量测序(NGS)进行检测,其中9对panel检测(678个基因)以及3对全外显子检测(WES),分析比较骨肉瘤原发灶与转移灶的基因图谱差异:基因拷贝数变异通过EXCAVATOR检测;DNA层面的融合突变通过Lumpy检测;RNA层面的融合突变通过Defuse+STAR-Fusion,并通过Circos图显示突变的分布;Metascape用于分析差异基因的GO和KEGG信号通路富集;使用Pyclone+Citup/LICHEE进行克隆进化分析。
【结果】骨肉瘤基因总体突变模式主要以基因扩增为主,主要包括FLCN(37.5%),GID4(37.5%),TP53(33.3%),ATRX(25%),CALR(25%),CCND3(25%) ,CCNE1(25%),NOCR1(25%),TFEB(25%),VEGFA(25%)等基因。
GO聚类结果提示细胞周期通路突变频率最高。
KT1、PLCG2、EGFR这3个基因在转移灶显著富集的信号通路中多次出现,可能与骨肉瘤的转移密切相关。
转移灶肿瘤负荷突变(TMB)频率显著高于原发灶(P=0.013)。
3例进行WES检测的转移患者均呈现线性克隆进化,提示骨肉瘤转移基因的突变可能呈次序性累积。
同时我们确定了可能在骨肉瘤进展中发挥作用的新候选基因,包括PLCG2、MYO15A与PEX6。
【结论】骨肉瘤发生与转移的基因突变模式主要以基因扩增为主,骨肉瘤患者肿瘤负荷突变频率在转移灶中显著高于原发灶,转移患者存在相互关联的线性基因克隆进化。
焦磷酸测序法检测ABCB1基因rs1045642多态性的研究
焦磷酸测序法检测ABCB1基因rs1045642多态性的研究隋雷鸣;付文卓;赵焕英【摘要】目的采用焦磷酸测序技术,建立适用于临床的ABCB1基因C3435T(rs1045642)多态性检测方法.方法选择首都医科大学附属天坛医院长期随访或住院治疗的癫痫患者50名,提取血液基因组DNA,针对ABCB1基因rs1045642位点设计PCR扩增引物和焦磷酸测序引物.用生物素标记的引物进行PCR扩增,PCR产物纯化并变性为单链后,用Qiagen PyroMark Q24焦磷酸测序仪进行测序和结果分析,采用 Sanger一代测序技术对焦磷酸测序结果进行验证.结果根据出峰的碱基和峰高来判断rs1045642位点的基因型,检测结果与Sanger测序比对,结果基本一致.50例样品中,TC型23例,占46% ;CC型16例,占32% ;TT型11例,占22%.结论本研究建立的焦磷酸测序检测ABCB1基因rs1045642多态性的方法操作简单、快速、准确,是目前理想的应用于临床的检测方法.【期刊名称】《继续医学教育》【年(卷),期】2018(032)010【总页数】2页(P137-138)【关键词】焦磷酸测序;ABCB1;C3435T;rs1045642【作者】隋雷鸣;付文卓;赵焕英【作者单位】首都医科大学中心实验室,北京 100069;首都医科大学中心实验室,北京 100069;首都医科大学中心实验室,北京 100069【正文语种】中文【中图分类】R742.l癫痫（epilepsy，EP）是以脑部神经元超同步放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征的神经系统常见的慢性疾病之一[1]，30%左右患者在经过抗癫痫药物（antiepileptic drugs，AEDs）治疗之后，仍不能有效控制发作，发展成为耐药性癫痫。
癫痫耐药机制尚未清楚，既往研究显示癫痫耐药性与血脑屏障上ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运体蛋白的过度表达相关，编码该类蛋白的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）影响转运蛋白的表达和功能而导致抗癫痫药物耐药[2]。
焦磷酸测序简介
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
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Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PCR引物（其中一条有生物素标记）必须 HPLC纯化或相当； PCR必须高保真，建议PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) ，扩增体系和条件 见右图； 一般用5~20ul扩增物 (Q24 Adv) ；
主要内容
一，焦磷酸测序简介
.
. 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 三，仪器维护
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Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
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Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
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Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序检测分析BRAF基因突变方法的建立
焦磷酸测序检测分析BRAF基因突变方法的建立周钢;钟焱【摘要】目的建立鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)基因V600E(T>A)突变位点的焦磷酸测序(PYRO)方法.方法提取100例结直肠癌患者的gDNA,采用Qigene pyro24测序仪进行BRAF基因的PYRO,并通过重复性试验和Sanger测序法验证方法的正确性.结果建立了BRAF基因V600E突变位点的PYRO方法,经重复性试验和Sanger测序验证,结果准确可靠,100例结直肠癌患者的标本中共检测出6例有基因突变.结论建立的BRAF基因突变的PYRO方法具有快速、简便、灵敏度和准确性高的优点,适用于科研和临床批量检测.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2018(033)012【总页数】5页(P1127-1131)【关键词】焦磷酸测序;鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1;结直肠癌;基因突变【作者】周钢;钟焱【作者单位】中南大学湘雅医院临床药理研究所,湖南长沙 410078;长江卫生职业学院,湖南长沙 410100【正文语种】中文【中图分类】R446.1鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-raf murine sarcoma viral oncogenehomolog B1，BRAF）是人类最重要的原癌基因之一，含18个外显子和17个内含子，定位于染色体7q34，长约190 kb，是一种鸟苷酸结合蛋白活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞、分裂和分化的有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activiated protein kinese，MAPK）信号通路方面具有重要作用。
BRAF基因发生突变后会促进细胞的有丝分裂，导致细胞异常增殖和分化。
其突变类型主要有2种：一是位于11号外显子的G463/G465/G468突变，二是位于15号外显子的V600E突变[基因序列的1799位T突变为A或C，导致核苷酸序列第600位的缬氨酸（V）被谷氨酸（E）替代]，其中后者占80%以上。
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意义 （ ０ ． ０ ５ ） ， 但 是 骨 肉瘤 的发 病风 险仍 呈上 升趋 势 。 结 论 Ｃ ＯＬ Ｉ Ａ１基 因多态性 与 骨 肉瘤 的发生 具有 相关 性 ， 携
带Ｃ Ｏ Ｌ １ Ａ基 因 Ｔ等 位基 因 的发 生骨 肉瘤 的风 险增 高 。
【 关 键 词】 骨 肉瘤 ； Ｉ型胶 原 ； 基 因多 态性
【 摘要 】目的 观 察骨 肉瘤 患者 Ｉ型胶 原 ｃ ｔ ｌ （ Ｃ Ｏ Ｌ Ｉ Ａ１ ） 基 因多 态性 ， 探 讨 骨 肉瘤 与 Ｃ Ｏ Ｌ １ Ａ１基 因多 态性 的 相关 性 。 方 法 收集 骨 肉瘤 以及 正 常患 者外 周 血样 本 ， 应 用 焦磷 酸测 序 方法 （ Ｐ ｙ ｒ ｏ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｅ ｉ ｎ ｇ ） 对 ５ ４例 骨 肉瘤 患者 与 １ ２ ６例
健 康对 照 者 Ｃ Ｏ Ｌ １ Ａ１基 因 ｒ ｓ ｌ ０ ６ １ ９ ７ ０位 点进 行分 析 。 结 果 ５ ４例 骨 肉瘤 患者 Ｃ Ｏ Ｌ １ Ａｌ ｒ ｓ ｌ ０ ６ １ ９ ７ ０位 点 基 因型 频率 中， ｒ Ｉ Ｔ（ １ ３ ． ０ ％） 和Ｃ Ｔ（ ４ ８ ． １ ％） 要 显著 高 于 正 常对 照 组 １ Ｔ Ｉ ’ 基 因型频 率 １ １ ． ９ ％及 ｃ Ｔ等 位 基 因频 率 ３ ０ ． ２ ％（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 骨 肉瘤 患者 组 中 Ｔ等 位 基 因的频 率 为 ３ ７ ． ０ ％， 高 于 对照 组 的 ２ ７ ． ０ ％， Ｏ Ｒ为 １ ． ５ ９， ９ ５ ％ｃ ， ０ ． ９ ９ ～ ２ ． ５ ７ ， 差 异无 统 计 学
中 国 现 代 医 生２ ０ １ ５ 年１ 月 第 ５ ３ 卷 第 ３ 期
・ 基 础 医学 ・
焦磷 酸测序用 于 Ｃ ＯＬ １ Ａ１ 基 因多态性 与骨 肉瘤 易感性 关系分析
颜茂 华 许 斌 赵 立 来 朱求亮 罗建 民 杨正 明 １ ． 浙 江省 安吉 县 人 民医 院骨科 ， 浙江 安吉 ３ １ ３ ３ ０ ０； ２ ． 浙 江大学 医学 院 附属第 二 医 院骨科 ， 浙 江杭 州 ３ １ ０ ０ ０ ９
［ 中图分 类 号】Ｒ ９ ６ ６ ； Ｒ ９ ７ ９ ． １
［ 文献标 识 码】 Ａ
【 文章编 号】１ ６ ７ ３ — ９ ７ ０ １ （ ２ ０ １ ５ Ｊ ０ ３ － ０ ０ １ ９ — ０ ４
ＣＯＬ１ Ａ１ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍｓ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｂ ｙ ｐ ｙ ｒ ０ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｓ Ｕ Ｓ －