杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析_陈喜

第30卷第6期浙江林业科技Vol. 30 No.6 2 0 1 0年11月JOUR. OF ZHEJIANG FOR. SCI. & TECH. Nov., 2 0 1 0 文章编号：1001-3776（2010）06-0006-06杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析陈喜，童再康*，黄华宏，林二培，程龙军（浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江临安 311300）摘要：以杉木（Cunninghamia lanceolata）茎叶为材料，根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）基因保守区设计简并引物，采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA （命名为CLCCR），该基因cDNA序列全长1 379 bp，具有一个975 bp的开放阅读框（Open Reading Frame，简称ORF），编码324个氨基酸，序列分析表明：杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉（Picea abies，CAK18610.1）CCR基因具有87%的相似性；与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松（Pinus massoniana）、火炬松（P. taeda）的亲缘关系较近。

关键词：木质素；cDNA克隆；杉木；序列分析中图分类号：S791.27 文献标识码：AGene Cloning and Sequence Analysis of CCR inCunninghamia lanceolata Lignin SynthesisCHEN Xi，TONG Zai-kang，HUANG Hua-hong，LIN Er-pei，CHENG Long-jun（School of Forestry and Bio-technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）Abstract: Cinnamoyl-CoA reductase(CCR) is one of the key enzymes in the process of lignin synthesis. A full length cDNA from the Cunninghamia lanceolata was amplified by RT-PCR and RACE. The full cDNA named CLCCR which was 1379 bp in length, and with an open reading frame of 975 bp encoding 324 amino acids. Sequence analysis demonstrated that nucleotide sequences of C. lanceolata CCR had 87% of genetic relationship with that of Picea abies one. Cluster analysis on CCR amino acids sequence of other plants showed that C. lanceolata had close relationship with P. abies, Pinus massoniana and P. taeda.Key words: lignin; cDNA cloning; Cunninghamia lanceolata; sequence analysis木质素（lignin）是一种由肉桂醇等单体聚合而成的酚类多聚体，是维管植物细胞壁的重要组成成分，在木材植物中含量较高，一般约占干重的15% ~ 35%，为地球上仅次于纤维素的有机组分[1]。

木质素的生物合成是在一系列酶催化下使苯丙氨酸或酪氨酸逐步转化为木质素单体，最终聚合成木质素的过程。

肉桂酰CoA还原酶（Cinnamyol Co-A Reductase，CCR）是影响木质素合成的一个关键酶，负责将各种羟基肉桂酰—辅酶A（CoA）酯最终还原成各种木质素单体，对木质素的合成与代谢也起关键作用。

木质素总含量和单体组成对植物体的最终用途起着决定性作用。

CCR基因除了影响木质素合成，还影响木材的微纤夹角（Microfibral Angle，mfa或MFA），进而导致材质密度和硬度的变异[2]，因此对CCR基因进行克隆和研究具有重要的实际意义[3~4]。

杉木（Cunninghamia lanceolata）属杉科（Taxodiaceae）杉木属（Cunninghamia），是我国特有的常绿针叶6期陈喜，等：杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析7树种之一。

杉木生长快，木材纹理直，结构细，耐腐力强，用途广泛，又因其萌芽力强，成林迅速，故成为重要的商品用材和造林树种。

建国后，我国加强了杉木科研工作，并取得了重要和丰硕成果[5~8]，涉及杉木森林培育、经营、遗传育种、计测、木材加工利用等领域[9~11]，其中杉木遗传改良研究最为活跃，研究成果及报道文献最多。

对杉木的CCR基因进行克隆，并与近缘属树种进行对比分析发现CCR基因变异情况，以期为杉木育种、遗传进化及转基因研究提供基础遗传学数据。

本文应用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）等分子生物学方法，获得杉木木质素生物合成酶CCR基因的全长cDNA序列，并进行生物信息学分析，为CCR的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料杉木材料采集于浙江林学院教学实习基地杉木种子园内。

样品采集后，直接于液氮速冻，带回实验室，用于mRNA的提取。

1.1.2 试剂 Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、RNA逆转录试剂盒、克隆载体均购自TaKaRa公司；RACE试剂盒购自Clontech公司；其他试剂为进口或国产分析纯；宿主菌为E.coli DH5α，为本实验室保存。

测序由南京金思特公司完成。

1.2 方法1.2.1 杉木RNA的提取参考相关的文献，采用改良的CTAB法进行提取[12~16]，具体方法如下：取1 g杉木茎和叶，液氮研磨后用药匙将粉末加入到65℃水浴的700μL提取液中，用手摇动混匀。

然后65℃水浴20 min后冷却至室温。

加等体积（700μL）的氯仿/异戊醇（24：1），混匀，10 000 r/min，4℃离心10 min。

小心吸取上清液，重复上述步骤，直至中间层无白色絮状沉淀。

吸取上清液，加1/4体积的10M LiCl混合，4℃沉淀过夜，然后10 000 r/min离心20 min。

弃上清液，用500μL SSTE溶解沉淀，加等体积氯仿/异戊醇混匀（24：1），10 000 r/min，4℃离心10 min。

离心吸取上清液，加2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少30 min，或－20℃下沉淀2 h。

12 000 r/min，4℃，离心20 min，去上清液，用75%的乙醇洗2次12 000 r/min，4℃离心5 min，小心弃上清液，吹干沉淀。

用40μL DEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。

1.2.2 CCR基因cDNA部分序列的克隆 cDNA合成：按照反转录TaKaRa PrimscriptTM RT-PCR Kit试剂盒（TaKaRa）的说明进行总RNA的反转录反应，获取cDNA。

1.2.2.1 RT-PCR扩增①引物设计。

根据GenBank中各种植物的CCR基因的核酸序列进行同源性比较，找出保守的区段，依据同源性高和简并性低的原则，设计一对简并引物：CCR-D-U 5’-GWASAAATGGTGGAGCCGC-3’CCR-D-L 5’-CCACGGTGGAGVACRCTCTC-3’引物由上海生工合成；②进行RT-PCR扩增，扩增体系为20μL体系，其中cDNA 2μL，10×PCR buffer 2μL，2.5 mM dNTP Mixture 0.8μL，5 U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.1μL，10μM Forward Primer 0.2μL，10μM Reverse Primer 0.2μL，ddH2O14.7μL。

扩增条件采用Touchdown PCR进行，反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃ 30 s，72℃延伸1 min，共14个循环，每个循环下降1℃；94℃变性30 s，54℃ 30s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。

RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将回收产物进行目的片断的克隆和重组子筛选，并将目的基因片段测序鉴定。

1.2.3 杉木CCR基因cDNA片段3’端和5’端的扩增RACE采用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences Clontech)，方法按照说明书再稍加改良。

①RACE引物设计及扩增。

反应利用Primer 5.0软件设计基因特异引物GSP1：5’>TGCTGGCATTGATGGCAGATGCAG<3’，用于3’-RACE；GSP2：5’> GGTACGCCGTGTGGTGTTTACATCT < 3’，用于5’-RACE。

按Clontech Smart RACE试剂盒说明操作，首先制备RACE-cDNA，然后进行RACE-PCR。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

②RACE产物的克隆测序和cDNA8 浙 江 林 业 科 技 30卷 全长获得。

3’RACE 产物、5’RACE 产物分别用pGEM-T 载体连接，经Amp 抗性筛选、X-gal/IPTG 蓝白斑显色筛选、重组质粒酶切鉴定后，送生物技术公司测序。

将3’RACE 产物测序结果和5’RACE 产物测序结果拼接为杉木CCR 基因全长cDNA 序列，将此cDNA 序列GenBank 数据库进行核苷酸同源性比较分析。

利用DNA-STAR 软件分析测序结果的序列与拼接结果的序列，最终将所得到的序列在NCBI 的Blast 进行比对，核苷酸序列的相似性比对在NCBI 的Blastn （/blastn ）中分析，并确定开放阅读框分析（ORF ），将其推导相应的氨基酸序列。

蛋白质氨基酸相似性比对在NCBI 的Blastp 中分析；同样，运用Mega3.0软件对推导的氨基酸序列与已知报道植物推导的氨基酸序列进行系统进化分析。

2 结果与分析2.1 杉木次生木质部总RNA 的提取采用CTAB-LiCl 法提取杉木次生木质部总RNA ，经琼脂糖凝胶电泳检测，测得结果见图1。