山茱萸多糖提取中蛋白质去除方法的研究_雷呈

关键词： 多糖; 脱蛋白; 正交试验; 酶 － Sevag 法
中图分类号： R284． 3
文献标志码： A 文章编号： 1673 － 7717( 2013) 06 － 1387 － 03
Study on Removal of Protein from Polysaccharide of Cornus Officinalis Sieb． et Zucc
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学 刊
第 31 卷 第 6 期 2013 年6 月
中华中医药学刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
按如下实验方案进行： 山茱萸热水提取→过滤→减压 浓缩→透析→醇沉→脱蛋白→醇沉→洗涤→真空干燥→山 茱萸粗多糖。 1． 3 葡萄糖标准曲线的制备
准确称取 105 ℃ 干燥至恒重的葡萄糖，超纯水溶解定 容于容量瓶，使其溶液 浓 度 为 0． 1 mg / mL。分 别 吸 取 0、 0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8 mL 于 10 mL 试管中， 加水补至 1 mL，加入 5% 重蒸酚 1 mL，摇匀，迅速加入浓硫 酸 5 mL，迅速混匀，室温静置 10 min，置沸水浴（ 恒温） 中加 热 15 min，用自来水冷至室温，在 490 nm 处测吸光度值。 以葡萄糖含量（ μg） 为横轴，吸光度为纵轴建立葡萄糖标准 曲线，得到回归方程 y = 0． 0122x + 0． 0484 和相关系数 R2 = 0． 9992，见图 1。
摘 要： 目的: 比较 Sevag 法、酶法、酶法 － Sevag 法，选择最优的脱蛋白方法，为山茱萸多糖的分离纯化、结构
鉴定提供实验基础。方法: 以多糖损失率、蛋白质脱除率和蛋白质含量为评价指标，选用 Sevag 法、酶法和酶 －
Sevag 法分别对山茱萸粗多糖进行脱蛋白。对酶法进行正交试验，筛选最优的工艺。结果: Sevag 法、酶法、酶 －
［1］ 王晖，周建扬，陈霞波，等． 降浊合剂治疗气虚痰浊型 2 型糖 尿病 66 例临床研究［J］． 中医杂志，2007，48（ 9） ： 803 － 805．
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Sevag 法的蛋白脱除率分别为 84． 50% 、78． 55% 、81． 24% ，多糖损失率分别为 61． 30% 、28． 54% 、10． 13% ; 酶法最优工
艺条件是酶量 4． 0% 、时间 2 h、温度 60 ℃ 、pH 值 6． 8。结论: 酶 － Sevag 法是山茱萸粗多糖脱蛋白最有效方法。
对山茱萸多糖，文献多采用 Sevag 法脱蛋白［8 －9］，未见 对山茱萸多糖脱蛋白进行系统研究。本实验根据山茱萸多 糖粗提物中蛋白质特点，分别采用 Sevag 法、酶法、酶法 － Sevag 法，对提取的山茱萸粗多糖进行脱蛋白试验，系统研究 这几种方法的除蛋白效果和多糖损失情况，选择最优的脱蛋 白方法，为山茱萸多糖的分离纯化、结构鉴定提供实验基础。 1 材料和方法 1． 1 材料、试剂与仪器
第 31 卷 第 6 期 2013 年6 月
中华中医药学刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 6 Jun． 2 0 1 3
山茱萸多糖提取中蛋白质去除方法的研究
雷呈，李弋
（ 南阳医学高等专科学校基础医学部，河南 南阳 473000）
等方面具有重要的生物学活性［1 － 3］，是临床上最常用的名 贵中药材之一。随着对多糖活性的深入研究，多糖在药物 上的应用越来越多。为此，人们对多糖的药理作用研究和
养阴化浊； 葛根功能升清，升提脾气； 丹参性凉润，活血补 血，通畅脾胃络脉结滞，恢复脾胃生化之能，充足脾胃气血 之源； 诸药合用调动脾胃气化功能，升清降浊。现代药理已 有研究证明，黄芪、绞股蓝、苍术有降脂及降糖作用； 丹参、 葛根有明显的改善胰岛素抵抗作用。
Key words： Cornus Officinalis Sieb． et Zucc； polysaccharide； removal of protein； orthogonal test； enzyme － Sevag method
山茱萸（ Cornus officinalis Sieb． et Zucc） 为山茱萸科植 物山茱萸的干 燥 成 熟 果 肉，具 有 补 益 肝 肾，涩 精 固 脱 的 作 用，在免疫调节、抗肿瘤、抗感染、抗氧化、降血糖、代谢调节
本研究结果提示，降浊合剂较长期的服用，能有效改善 气虚痰浊型糖尿病前期患者的糖代谢紊乱，对其空腹血糖、 空腹胰岛素及空腹胰岛素敏感性指数具有显著的改善作 用，同时能够改善 TG、LDL、FFA 水平。通过 1 年的随访发 现，降浊合剂能够有效降低糖尿病前期患者的 1 年糖尿病 转化率，优于单纯采用饮食控制及运动锻炼的对照组。
本研究 治 疗 组 和 对 照 组 的 脱 落 样 本 率 较 高，高 达
收稿日期： 2013 － 01 － 05 基金项目： 南阳市科技攻关计划项目（ 2009GG040） ； 南阳医学高等
专科学校科学研究基金资助项目（ 12NYY2014） 作者简介： 雷呈（ 1972 － ） ，男，河南信阳人，讲师，硕士，研究方向：
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多糖提取纯化方面都做了大量的工作和深度报道［1 － 5］。 目前山茱萸多糖提取方法较多，但在提取过程中都有
蛋白质混杂于山茱萸多糖中，蛋白质的存在，导致所提取的 山茱萸多糖的纯度不高，降低了山茱萸多糖的生物学活性。 所以除去蛋白质是多糖提取纯化的一个关键环节。文献报 道脱蛋白的常用方法是 Sevag 法、酶法、TCA 法（ 三氯乙酸 法） 、酶法 － Sevag 法［6 － 9］。
平均值，根据标准曲线确定样品中多糖含量和多糖损失率。 多糖损失率 = （ G1 － G2 ） / G1 × 100% 公式中 G1 为提取物中多糖的质量，G2 为脱蛋白后多糖
的质量。 1． 5 山茱萸粗多糖中蛋白质含量和蛋白质脱除率的测定
蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法 （ Bradford 法） ［6］， 以牛血清白蛋白作标准曲线。 1． 5． 1 蛋白质标准溶液的制备 精确称取牛血清白蛋白 10 mg，置于 100 mL 量瓶中，加生理盐水溶解后稀释至刻度 制成 100 μg / mL 贮备液。 1． 5． 2 蛋白质标准曲线的制备 分别吸取贮备液 0． 0、 0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 mL 分别放于 1、2、3、4、5、6 只试管 中，加蒸馏水稀释至 1． 0 mL，向各管中加入 5 mL 考马斯亮 蓝 G － 250 溶液，混合均匀后室温放置 2 min，以 1 号试管为 空白，在 595 nm 波 长 处 测 定 吸 光 度，得 到 回 归 方 程 y = 0． 0056x + 0． 1136 和相关系数 R2 = 0． 9994。 1． 5． 3 山茱萸粗多糖中蛋白质含量和蛋白质脱除率的测 定 取样品溶液各 1． 0 mL，同时做 3 个重复，以空白试剂 为参比，按照制备标准曲线的步骤操作，分别测定其吸光度 值，计算 3 个重复的吸光度平均值，根据标准曲线确定样品 中蛋白质的含量和蛋白质脱除率。
蛋白质脱除率 = （ P1 —P2 ） / P1 × 100% 公式中 P1 为粗多糖中蛋白质的质量，P2 为脱蛋白后多 糖中蛋白质的质量。 1． 6 Sevag 法脱蛋白 向山茱萸粗多糖浓缩液中加入其体积 1 /5 的氯仿 － 正 丁醇（ 5 ∶ 1） 溶液，剧烈震荡 30 min，在转速为 4000 r / min 下 离心 10 min，去除沉淀后，测定水相中蛋白浓度。取上清液 再加入其体积 1 /5 的氯仿 － 正丁醇溶液，重复多次，直到无 明显的沉淀产生为止。每脱蛋白 1 次，除去沉淀后，测定和 分析溶液中山茱萸多糖的损失率及蛋白质脱除率。 1． 7 酶法脱蛋白 用链霉蛋白酶处理山茱萸多糖。根据资料和文献报 道，分别用酶量、处理时间、处理温度、pH 值等因子进行单 因素实验，在此基础上，以蛋白质脱除率（ % ） 为考察指标， 进行 L9 （ 34 ） 正交试验，反应结束后沸水浴 5 min 终止酶反 应，离心，测定蛋白质脱除率（ % ） ，进行方差分析，并以最 佳工艺条件进行确证试验。
生物化学的教学与研究。
16． 3% ，考虑有两方面的原因，一是根据 ADA 诊疗规范，被 诊断为糖尿病前期后，应进行 2 个月的运动锻炼和饮食控 制，如无效则可进行药物干预治疗，入选病例对单纯进行运 动锻炼及饮食控制信心不足或者不能坚持； 二是患者对较 长期的中药汤剂口服认可度较低，中药治疗组脱落病例中， 已得到的反馈信息大部分为因为各种原因没有条件长期口 服煎剂，在研究过程中，没有因为服用降浊合剂导致不适而 停止服用的反馈，所以改善中药汤剂的剂型对于中药的推 广应用有着重要意义。 参考文献
LEI Cheng，LI Yi
（ Department of Basic Medicine of Nanyang Medical College，Nanyang 473000，Henan，China）
Abstract： Objective： To compare the Sevag method，the enzymatic method and the enzyme － Sevag method in order to choose the best methods of removing protein from Cornus Officinalis Sieb． et Zucc and to provide experimental basis for separation purification and structure determination of polysaccharide of Cornus Officinalis Sieb． et Zucc． Methods： Polysaccharide loss rate，protein removal and protein content were as the evaluation indexes． The Sevag method，the enzymatic method and the enzyme － Sevag method were used to remove protein． The enzyme method was selected by orthogonal tests． Results： The remove protein rates of the Sevag method，the enzymatic method and the enzyme － Sevag method were 84． 50% ，78． 55% ，81． 24% and the polysaccharide loss rates were 61． 30% ，28． 54% ，10． 13% ； the optimum conditions of enzymatic method were 4． 0% enzyme amount，2 h，60 ℃ ，pH = 6． 8． Conclusion： The enzyme － Sevag method is the most effective way to remove protein．