《微生物技术大实验》实验指导
《大学课件：微生物学实验技术》
1
菌落计数
学习使用菌落计数法来估算微生物的
培养曲线
2
数量。
了解培养曲线的特点和分析方法，研
究微生物的生长动力学。
3
生长速率
掌握计算微生物生长速率的方法和相 关参数。
常见微生物的培养和鉴定方法
革兰氏染色
掌握革兰氏染色技术，区 分细菌的阳性和阴性特征。
特定培养特性
了解某些微生物的特定培 养特性，如产气、荧光等。
1 增殖速率
了解细胞增殖的原理和 速率控制因素。
2 细胞计数
学习使用显微镜和自动 计数器进行细胞计数。
3 生物量分析
了解生物量分析的方法 和应用，如干重法和荧 光法等。
无菌操作技术
1
消毒与灭菌
学会对培养皿、培养工具和培养基进
传递培养物
2
行消毒灭菌。
掌握无菌操作技术，避免细菌和真菌
的污染。
3
环境监测
了解微生物实验室的环境监测方法和 标准。
纯培养基的制备
琼脂平板制备
液体培养基制备
学习制备琼脂平板和琼脂斜板， 作为微生物培养的基础。
掌握液体培养基的制备方法， 用于大规模培养微生物。
学会正确的洗手、穿戴实验服和佩戴防护设备等个人卫生常识。
4 废物处理
了解废物处理的规定和流程，保护环境。
微生物实验室的安全与保护
生物安全级别
了解微生物实验室的安全 级别分类，确保实验室的 安全性。
防护措施
学习使用防护设备和采取 预防措施来保护自己和实 验环境。
危险物质处理
熟悉处理危险物质的方法 和相应的应急措施。
生物化学测试
学习常见的生物化学测试 方法，如氧化-发酵试验等。
微生物工程实验指导
微生物工程实验指导适用生物技术专业食品与生物工程学院2008.1实验一 发酵实验用玻璃器皿灭菌前的包扎方法一、目的：学习发酵实验用玻璃器皿在灭菌前的包扎工作，并了解灭菌后的使用方法。
二、原理：为保持发酵实验用玻璃器皿灭菌后的无菌状态，需要对它们灭菌前进行包扎，这些工作看起来简单，但如操作不当或不按操作规程去做，则会影响实验结果，甚至会导致实验的失败。
三、材料和设备5ml吸管30只，9cm培养皿 10套，120*12mm试管 120只，250ml三角瓶30个，脱脂棉0.5斤，天然棉0.5斤，8层纱布30块，线绳。
四、方法1、洗涤1 新器皿应用2﹪盐酸浸泡数小时再洗涤。
2 琼脂块不能倒入下水道。
3 含菌培养基一般先煮再洗。
4 洗涤后玻璃器皿上水应均匀湿润而无条纹和水珠。
2、包扎① 平皿的包扎：10个一包。
前9个方向一致，最后一个反放，用纸卷成卷，也可放在特制铁桶中灭菌。
② 吸管的包扎：在吸管尾部塞入少许脱脂棉，脱脂棉长约1cm，距管口约0.5cm，以防止在使用时造成污染。
脱脂棉松紧适当，多余的棉花可用火焰烧掉。
每支吸管用约6cm宽纸条，吸管头部包衬双层纸，以30－45º卷起，吸管尾部用剩余纸条打成一结，防止散开，标上容量。
使用时，从吸管中间凝断包扎纸带，抽出吸管。
③ 试管的包扎：用天然棉做成棉塞，紧贴管臂，松紧适宜，棉塞要实，2/3塞进管口。
也可用硅胶塞。
十只一把，外加牛皮纸，扎好。
脱脂棉易吸水，可能造成染菌。
④三角摇瓶的包扎：用8层纱布（大小适宜），塞入瓶口2/3，瓶外部分揪成一团，再用一层牛皮纸或两层报纸把纱布遮严（以免打湿），包扎，用绳子系成活扣。
使用时，去掉包扎纸，拿去纱布，接种后，将纱布塞进瓶口，纱布四角拉下，用绳子系成活扣。
五、作业体会这样做有哪些好处？实验二 灭菌技术及其应用一、目的：掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和操作。
二、原理：灭菌的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌目的。
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
微生物测试作业指导书
微生物测试作业指导书编制：岗位：理化工程师签字：日期：审核：岗位：理化主管签字：日期：批准：岗位：质量经理签字：日期：1.目的：为了对口罩产品和初包装材料的微生物限度和控制菌进行有效控制且满足相应销售区域的标准,特制定本测试作业指导书。
2.范围：适用于本公司口罩产品及初包装材料的微生物检测。
3.职责3.1 质量部负责按照本规程的要求对初包装材料的微生物限度以及口罩产品的细菌、真菌总数和控制菌（大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）进行检验，并出具判定报告。
3.2质量部负责定期对检测结果进行汇总及趋势分析。
3.3质量部负责本文件的编制、审核、批准。
4.工作程序4.1 测试标准：●YY 0469-2011医用外科口罩●GB 19083-2010 医用防护口罩技术要求●GB 15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准●EN 14683:2019 Medical face masks-Requirements and test methods●《中国药典2015版四部》4.2样品的取样数量：对于符合GB 19083-2010、YY 0469-2011和YY /T 0969-2013的口罩产品，取同一生产批的4个样品用于检测。
对于符合EN 14683:2019的口罩产品，取同一生产批的5个样品用于检测。
4.3控制标准：4.3.1产品相关控制标准医用防护口罩（GB 19083-2010）：医用外科口罩（YY 0469-2011）和一次性使用医用口罩（YY /T 0969-2013）：医用口罩（EN 14683:2019）微生物限度标准：≤30cfu/g4.3.2初包装材料微生物控制标准5.检测方法5.1 检测前准备5.1.1培养基a)需从合格供应商处购置成品培养基，作为支持微生物生长繁殖或新陈代谢产物的营养基础。
b)配置前需检查培养基名称和批号，打开后观察有无大型结块和污染。
如果出现上述现象不得使用。
食品微生物学实验指导书
食品微生物学实验指导（食工、烹饪专业用）目录实验一显微镜的构造及使用方法 (5)实验二酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 (9)实验三霉菌的形态观察 (11)实验四细菌的简单染色与形态观察 (13)实验五细菌的革兰氏染色与芽孢染色 (14)实验六培养基的制备与灭菌 (16)实验七细菌的分离培养及培养性状的观察 (22)实验八酵母菌细胞计数 (30)实验九食品中细菌总数的测定 (32)实验十食品中大肠菌群数的测定 (37)附录一常用染色液 (44)附录二常用培养基配方 (45)实验室安全守则1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。
2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。
3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。
4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。
5.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。
6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是否正常，并认真记录。
关好门窗，方可离去。
实验室检验总则一、样品的采集（一）采样目的确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。
（二）采样原则1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。
2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。
3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。
微生物实验操作
表面消毒及分离纯化植物样品的预处理将新收集沙棘的茎，叶子，根，果实用干净的保鲜袋装好，回实验室后用自来水冲洗洁净，把已经碎掉的沙棘筛选出来不要，里面可能已经有微生物已经感染了，准备几个保鲜袋装好，放冰箱里，把茎，叶子，根，果实分开装，尽量不要茎，叶子，根，果实弄破碎了。
需要做分离纯化时把茎，叶，根用70的乙醇喷一下，立刻用无菌水再冲洗一遍，用无菌的剪刀剪成2-3厘米的小段，然后把完成上述操作后分别将沙棘的茎，叶，根，果实放入到无菌的广口瓶中以备下一步的消毒处理（如果不能及时进行以上处理的，应先将采集好的样品放到4℃的冰箱中进行存放，并在一周内完成对样品的处理）。
准备无菌的广口瓶，准备一大瓶无菌水，灭菌的剪刀，一个酒精喷壶，封口膜，保鲜袋。
表面消毒及分离纯化（1）根，茎的表面消毒。
以75%乙醇溶液和2%的次氯酸钠溶液作为表面消毒剂进行沙棘表面消毒。
将上述处理好的广口瓶中的茎段和根段，先用无菌水轻轻冲洗2次，用灭菌的纱布，或用无菌的镊子抵住瓶口，把无菌水过滤出来，然后用75%乙醇溶液进行消毒25分钟左右，再用无菌水轻轻冲洗植物样品3次，之后用2%的次氯酸钠溶液进行消毒，最后用无菌水轻洗4次。
准备灭菌的纱布，灭菌的镊子，70%的乙醇，无菌水。
（2）叶，果实的表面消毒。
和上述的方法一样，只是不剪。
（3）分离纯化。
在超净工作台上将上述消毒好的沙棘的根，茎，叶子和果实等用无菌镊子放入到无菌的培养皿中。
沙棘的根部和茎部用无菌剪刀将两端和韧皮部剪去，之后将其表皮轻轻剥离，并用无菌手术刀竖切取其中间部位，用无菌剪刀裁剪成50mm×50mm大小。
沙棘的果实用无菌镊子夹破之后，将其表皮和籽剥离分开备用。
沙棘的叶子用无菌手术刀竖切取其中间部位用无菌剪刀裁剪成50mm×50mm大小。
将上述处理好的各部位材料分别放入到配好的细菌和真菌的分离培养基中进行培养（培养条件细菌37℃，真菌28℃）并做好标记。
对照实验：将上述表面消毒过的沙棘的各部位样品用无菌镊子在上述培养基中反复涂布2-3min，用移液枪吸取150uL最后一次冲洗材料的冲洗液，用无菌棉签或涂布棒均匀的涂布到两种培养基上，检测是否有有菌生长（培养条件同上）。
兽医微生物实验指导
兽医微⽣物实验指导兽医微⽣物实验教案实验⼀显微镜油浸系的使⽤及细菌基本形态构造的观察【⽬的要求】1.掌握正确使⽤及护理显微镜的⽅法，特别是油浸系的使⽤及护理。
2.正确认识细菌的基本形态和构造。
【油浸系的原理】油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴⾹柏油，调整光源检查细菌标本的⽅法。
油浸镜是⼀种⾼倍放⼤的物镜，⼀般都刻有放⼤倍数，如95×、100×等。
其镜头标记国产镜多⽤“油”字表⽰，国外产品则⽤“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表⽰。
⽽且油镜的镜⾝较⾼倍镜和低倍镜为长，镜⽚最⼩，这也是识别的另⼀种标志。
其使⽤原理是由于⾹柏油与玻璃的折光率相似(⾹柏油为1.515，玻璃为1.52)。
镜检时，滴加⾹柏油的作⽤是使光源尽可能多的进⼊物镜中，避免光线通过折光率低的空⽓(折光率为1.O)⽽散失，因⽽能提⾼物镜的分辨率，使物像明亮清晰。
【器材及试剂】1.菌种：⼤肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本⽚；2.仪器：普通光学显微镜；3.材料：⾹柏油，⼆甲苯，擦镜纸等。
【操作步骤】(⼀)细菌基本形态构造的观察1.准备安置显微镜→调节光源→调节双筒⽬镜间距→调节聚光器数值孔径值。
将光圈完全开放，升⾼聚光镜与载物台同⾼，置标本⽚于载物台上，在低倍镜下对光，⽤于转动反光镜以调节之，⾄视野最亮时为⽌。
若⽤天然光源宜⽤反光镜平⾯，较弱光源⽤凹⾯。
检查未染⾊标本，光不宜太强，染⾊标本需强光。
光线强弱可通过放⼤或缩⼩光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。
2.观察将⾹柏油⼀滴滴于标本⽚有颜⾊的观察区，并置于载物台上，⽤⽚夹固定好，⽤推进器将观察区置于物镜正下⽅，依次⽤⾼倍镜→油镜观察。
⽤油浸镜检查，使油镜头浸⼊油滴中，⼏乎与标本⾯接触为度。
然后由接⽬镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)⾄能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动⼀般不超过1周)，直⾄物像清晰为⽌。
微生物学实验教案 (2)
微生物实验教案实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理圈、:镜座、a：镜口角（即入射角）。
3油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。
四、实验方法与步骤（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
油镜使用的原理绘制细菌形态六、思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2使用油镜时，为什么必须用镜头油？七、实验注意事项1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。
当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以带正电荷的碱性染料。
染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2、培养12-18h的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。
3、简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）四、实验方法与步骤1、活菌制片观察取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养六、思考题1镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？2根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？七、教学反馈实验三细菌的革兰氏染色一、实验目的1掌握革兰氏染色。
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《微生物技术大实验》实验指导（适用专业：11级本科生物技术微生物学方向）柯野编韶关学院英东生命科学学院2014年实验一、重组毕赤酵母发酵表达蛋白酶及其初步鉴定一、实验目的1、学习重组毕赤酵母培养基产物表达的方法。
2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。
3、学习表达的重组蛋白酶的鉴定及其酶活的测定。
二、实验内容1、毕赤酵母的菌体生长和诱导表达的培养基的制备。
2、重组毕赤酵母生长菌体曲线的测定。
3、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达。
4、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。
5、SDS-PAGE鉴定重组蛋白酶。
三、实验原理蛋白酶是催化蛋白质化合物中肽键水解为小肽或氨基酸的一类酶总称，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微生物中，并且对生物体的生理调控、催化各种代谢反应等方面具有重要的作用。
蛋白酶是一类重要的工业用酶，约占整个工业用酶量60%以上；广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业。
由于蛋白酶具有广泛的工业、食品和医药等方面的应用价值，目前工业上需求量大。
植物中提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶。
植物蛋白酶生产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、气候等多因素的影响致使来源不稳定。
动物源性蛋白酶多从牛、羊和猪等的胰脏中提取而得。
动物来源蛋白酶生产成本较高，并受到世界动物保护协会和人员的强烈反对，目前主要用于医药方面。
因此，动植物源蛋白酶不能满足当代工业的需要。
微生物源蛋白酶几乎具有所有植物和动物来源蛋白酶的应用特性，成为了目前的蛋白酶的重要来源。
据统计，微生物蛋白酶占据了世界蛋白酶销售大约70%以上的份额。
目前商业化的蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋白酶来自植物木瓜，而来源于真菌的极少。
目前，国内外学者对来源于霉菌的蛋白酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提高蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究；而优化发酵条件很难大幅度提高蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生长状态)影响。
并且霉菌产生的蛋白酶种类较多，这增加了蛋白酶的纯化难度，阻碍了其进一步的开发利用。
因此采用基因工程技术，利用霉菌的蛋白酶基因整合到毕赤酵母的基因组上构建工程菌株，利于高产获得重组霉菌蛋白酶。
毕赤酵母表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表达量高。
该表达系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白，该目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化。
毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。
其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。
它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX-甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
四、器材与试剂1、菌种重组蛋白酶毕赤酵母工程菌株，本菌株由本实验室自己构建保藏。
2、培养基BMGY培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500×生物素溶液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甘油10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。
BMMY 培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500×生物素溶液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甲醇10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。
3、试剂福林试剂(Folin试剂)：于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4•2H2O) 100g，钼酸钠(Na2MoO4•2H2O) 25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10h。
取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水50mL，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。
冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗(No4-5)过滤，置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
0.4mol碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(Na2CO3) 42.4g，定容至1000mL。
0.4mol三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸(CCL3COOH) 65.4g，定容至1000mL。
pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O) 71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为1000μg/mL，再吸取此液10mL，以0.2N盐酸定容至100mL，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
电极缓冲液（pH 8.3）：0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris），0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）：称3.02 gTris、14.42 g甘氨酸，1g SDS，用蒸馏水定容至1000ml。
分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5 mol/L Tris-HCl 称18.171 gTris，80 ml蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 8.8，蒸馏水定容至100ml。
浓缩胶缓冲液（pH6.8）：0.5 mol/L Tris-HCl 称6.075 gTris，80ml蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 6.8，蒸馏水定容至100ml。
凝胶：30%丙稀酰胺（Acr）、1.6%甲叉双丙稀酰胺（Bis）称30 gAcr、0.8 g Bis，加少许蒸馏水热溶, 用蒸馏水定容至100 ml。
染色液：称2.5 g考马斯亮兰R-250，加500 ml甲醇，100 ml醋酸, 用蒸馏水定容至1000 ml。
脱色液：取250 ml甲醇，70 ml醋酸，用蒸馏水定容至1000ml样品缓冲液：取10% SDS 1ml，二巯基乙醇（13.5mol/L）0.6 ml，甘油1.5ml，0.05%溴酚兰少许，0.5mol Tris-HCl(pH6.8)定容至10 ml。
样品处理：将血清用样品缓冲液稀释至蛋白含量为1mg/ml，煮沸5min。
10% SDS：称10.0 g SDS，用蒸馏水定容至100 ml。
4、器材分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、pH计、离心机、电子天平、电泳槽等。
五、实验操作（一）配制BMGY和BMMY培养基1 称量：按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。
2溶解：向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。
3.调节pH值：用玻璃棒沾少许液体，测量pH值。
用氢氧化钠和盐酸调节PH，本实验采用的是缓冲液配制培养基，也需要培养基的最终pH。
4.分装及包扎：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。
最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
6.灭菌：高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20分钟。
（高压蒸汽灭菌器使用方法：加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。
盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。
通电加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气。
待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。
继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3℃)，开始计时，维持15-30min。
灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。
切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。
）7.灭菌后验证灭菌是否彻底：将培养基放置于37℃培养箱中，培养48 h，检测是否有菌生长。
（二）重组毕赤酵母生长曲线测定1、种子液制备取重组毕赤酵母工程菌株斜面菌株1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入BMGY 培养液中，250rpm，30℃振荡培养24 h。
2、接种培养用5ml无菌吸管，准确地吸取5ml重组毕赤酵母工程菌株的培养液，接种到灭菌装有50ml BMGY培养液的250ml的三角瓶中，接种后振荡，使菌体混匀。
3、培养将接种后三角瓶放置于摇床上，250rpm，30振荡培养。
分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30小时从三角瓶中取出一定体积的菌悬液，立即放4℃冰箱中贮存，最后一起比浊测定光密度值。
4、比浊测定以未接种的BMGY培养液作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。
从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的BMGY培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1-0.65以内，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。
（三）重组毕赤酵母的诱导表达1、取出冰箱中保存的重组毕赤酵母工程菌株，接种于含25mL BMGY 培养基的250mL 摇瓶中，28-30℃振荡培养（250～300rpm）至对数生长期OD600达2-6，约16-18h）。
2、室温下以3000 g 离心5min 回收酵母细胞。
弃去上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY 培养基中，至OD600值为 1.0-2.0（约100-200mL）。
3、将培养液置于1L 摇瓶中，覆盖两层无菌纱布和一层灭过菌的报纸，置摇床中，28～30℃继续培养并开始诱导表达（注意诱导温度应严格控制，不要超过30℃）。
4、诱导表达起始后，每隔12h 补加100%甲醇至终浓度为0.5%～2%以维持诱导。
5、诱导开始后，每隔24h 取样一次，直至168h。
每次取诱导培养液1mL 于1.5mL 离心管中，室温下以最大转速离心2-3min，将上清液和细胞沉淀分别冻存于-20℃。
（四）发酵液酶活的测定1、标准曲线的绘制1.1、按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。