CFSE 使用方法
CFSE活染方法Protocol
制作细胞悬液，加入等体积 CFSE 工作液，于 37℃孵育 10 min，用 40%体积的冷 小牛血清立即终止标记 10min。 离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细 胞。
CFSE 的浓度国外报道从 0.5uM~20uM 都有，建议终浓度为 2.5-5uM。浓度太低， 细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时 要经常摇匀。
试剂盒成分
• CellTrace™ CFSE (Component A), 10 瓶，每瓶 50 μ g • DMSO (Component B), 0.5 mL
使用浓度：
一般来说，长时间染色（超过三天）或快速分裂为 5～10uM，活力分析等短时间分析为 0.5～ 5uM。 荧光显微镜为 25uM。优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。
5. 37 ℃，避光放置 10min。
6. 250g 室温离心 10 分钟。弃上清，加入含 10%FBS 的完全 1640 培养液洗 2 次。 最后用 1ml R10 培养基（见附录 3）重悬。
7. 将上述细胞悬液加入 24 孔培养板,每孔 1mL,分别加相应的多肽库或者阳性 刺激物 SEB（Sigma, Cat# ）刺激 ,终浓度 1ug/ml
1．1
重悬细胞于预温的 PBS/0.1%BSA，浓度 1×10 6 /ml。
注意：为保证标记均匀，样本需为单细胞悬液。细胞浓度为 10 5 ~10 6 ,依标记后细胞的培养
时间而定。若需传代培养，浓度增加为 1～5×10 7。
1．2
每 ml 细胞中加入 2ul CFSE 贮存液，终浓度为 10uM。注意：最适工作浓度需优化，
二、CFSE 配制
用 DMSO 溶解成 5 mmol/L 的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清 DMEM 培养液稀释成 5μ mol/L 的工作液备用。CFSE 试剂盒内有一小瓶 CFSE（A 试剂） 标明 500ug ，另有一小瓶 DMSO（B 试剂），500ugCFSE 溶解于 180ulDMSO 即是 5mMstock solution。
CFSE染色方法
CFSE染色方法CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）染色方法是一种常用的荧光染色技术，通过这种方法可以追踪和分析细胞的增殖、分裂和活性等生理过程。
该方法利用CFSE荧光染料的特点，通过与细胞内的酯酶作用而形成的CFSE标记，来实现细胞的可见光荧光示踪。
1.准备CFSE染料溶液。
通常使用的浓度为5-10μM的CFSE染料溶液。
可以将CFSE染料溶于合适的溶剂中，如无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMSO（二甲基亚砜）等。
2.处理待染细胞。
将需要染色的细胞分离出来，通常采用离心法获取细胞沉淀物。
接下来，将细胞悬浮液转移到培养基中。
3.CFSE染料标记。
将CFSE染料溶液与待染细胞混合，使其浓度达到适当的标记浓度。
染色时间一般为10-30分钟，但是时间过长或过短都有可能影响染料的有效标记。
染色完毕后，可以通过加入等体积的培养基来停止反应。
4.清洗和处理标记细胞。
将染色细胞通过离心去除无效的染料溶液，然后用新鲜的培养基洗涤细胞，去除未结合的染料。
5.扩增和培养标记细胞。
将清洗干净的细胞转移到含有适当培养基、生长因子和补充物的培养皿中，进行培养和扩增。
6.荧光显微观察。
通过荧光显微镜观察染色细胞，使用合适的荧光滤镜来观察CFSE荧光的发射。
CFSE染色方法的优势是可以追踪不同细胞的活动和增殖过程，如细胞分裂、生长速度等。
此外，该方法简单、可靠、重复性好，并适用于各种类型的细胞。
通过CFSE染色可以实现对细胞的定量和定性分析，对研究细胞增殖、分化、迁移等生命过程有重要意义。
总之，CFSE染色方法可以通过荧光示踪技术追踪和分析细胞的增殖和分裂过程。
通过上述实验步骤，可以成功地进行CFSE染色实验，并通过荧光显微镜观察和分析染色细胞的活动状态。
这项技术在生物学、生物医学和药物研发等领域有着广泛的应用前景。
XoftSpySE 使用者手册
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CFSE细胞增殖实验
准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4.2.5ml RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% HeatInactivated FBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。
3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选naïve CD8a+ T细胞1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refr igerator (2−8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2−8 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11.Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer. 12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-throughcontaining unlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells thatpass through, representing the enriched naive CD8a+ T cells, andcombine with the flow-through from step 3. 14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
CFSE的配制和实验步骤
在使用前仔细阅读说明书-Cellstain-CFSE货号规格C375 1 mg荧光染料CFSE(CFDA-SE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。
其基本原理如下：CFSE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。
CFSE在结构上将酚羟基部位改造成AM体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，进入细胞内的CFSE的AM部位能被细胞内酯酶水解发出绿色荧光。
CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。
CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。
另外，CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。
建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、CFSE 的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。
配制试剂：1、从冰箱中取出CFSE试剂，放至室温后再打开。
盛放CFSE的管子开盖前请轻弹管壁几次，让粉末充分落入管底，必要时可采用离心的方法。
2、1000mgCFSE溶解于360ul的DMSO，制成5mM的储存液，于-20℃避光保存，使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μM的工作液备用。
a) DMSO 需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
b) 由于CFSE母液遇水极易分解，所以建议分装保存，例如分装成5μl/管。
（方法：分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。
）c) CFSE 工作液应现配现用，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。
【求助】荧光染料CFSE的配置与使用
【求助】荧光染料CFSE的配置与使用这是我根据同仁的说明书和网上查到的资料总结会总后的内容，你可以参考一下Cellstain- CFSE一羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE) 是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE 成为一种良好的细胞标记物[1 ] 。
CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时,CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对半递减,利用流式细胞仪在488nm 激发光和荧光1(FL1) 检测通道可对其进行分析Product Code: C375-10 Unit: 1 mg ，白或淡黄色粉末保存：－20℃ 运输：室温CFSE的配制和细胞染色程序DMSO是有机溶剂，对于蛋白质会有损伤，所以在配置的时候DMSO溶液越少越好；CFSE遇水容易分解，所以在配置时候要用无水DMSO，并且配置后尽快试验。
1、离心：3000rpm ?10min；2、取DMSO 180ul，稀释CFSE，超音波溶解，得到10mM CFSE保存液；将其按20ul体积分装于预遮光的无菌冻存管中，共分9管，标记后其中8管保存于－20℃。
另一管按10ul装于管中保存。
保存2个月。
3、取上余之10ul保存液，用PBS稀释至50ul，得到5mM的CFSE稀释液，保存于－20℃待用。
CFSE 标记细胞{KJ, 2002 #1}:标记浓度和条件：细胞通常用终浓度0.5－5μM的CFSE标记。
孵育时间5－10分钟，通常在10％FCS的PBS中染色，标记后细胞用完全培养介质洗涤，高蛋白灭活未反应的CFSE。
1、在有5％FCS的PBS重悬细胞，细胞浓度一般为1?106 （体外实验）?107/ml（转染实验）。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
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Detailed protocol is available online at /manuals.WARNING! For every chemical, read the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling instructions. Wear appropriate protective eyewear , clothing, and gloves. Safety Data Sheets (SDSs) are available from
/support.
Quick Protocol
1. Prepare a 5 mM CellTrace ™ CFSE stock solution by dissolving the contents of 1 vial of CellTrace ™ CFSE (Component A) into 18 μL of DMSO (Component B).
2. Dilute the 5 mM CellTrace ™ CFSE stock solution in phosphate-buffered saline (PBS) or other suitable buffer to a working concentration of 0.5–25 µM.
3. Centrifuge cells of interest to obtain a cell pellet. Aspirate the supernatant.
CellTrace ™ CFSE Cell Proliferation Kit
For research use only. Not for use in diagnostic procedures.
Cat. no. C34554 Pub. no. MAN0006887 Revision 1.0QuiCk REFEREnCE
4. Gently resuspend the cells in pre-warmed (37°C) CellTrace™
CFSE/PBS working solution (from step 2).
5. incubate the cells for 15 minutes at 37°C.
6. Centrifuge the cells and resuspend the cell pellet in fresh
pre-warmed medium.
7. incubate the cells for another 30 minutes. Re-wash the cells.
8. Set up in vitro cell cultures under appropriate conditions or
adoptively transfer cells.
9. Harvest cells and stain for other markers if appropriate.
10. Analyze using a flow cytometer with 488-nm excitation and
emission filters appropriate for fluorescein.
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8 February 2013。