1PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理

第一代：手动/机械手式水浴基因扩增
➢ 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR 的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸 温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在 不同温度的水浴箱中依次水浴。
➢ 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错； 而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无
荧光PCR的原理
实时荧光PCR常用的三个概念
➢ 扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次PCR扩 增都会自动记录荧光强度的变化
➢ 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光 信号指数扩增阶段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要 大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进 入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。
➢ 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数 字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。
➢ 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
二、PCR的发展史
➢ 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开 启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学, 分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。
➢ 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
➢ 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其 扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望 的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
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30次循环后靶序列扩增的数量
常用的ＰＣＲ技术
➢ 定性ＰＣＲ 电泳检测、放射自显影 特异性差、易污染、只能定性
➢ ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ 特异性较好，极易污染、定量不准确
➢ 终点法荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好
1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防
六、新冠病毒核酸检测原理
对新型冠状病毒（2019-nCoV） ORF 1ab 及编码核衣壳蛋白 N 或E基因的特异性保守序列为靶区域， 进行了双靶标基因的设计， 配以PCR 反应液， 在荧光定量 PCR 仪上， 应用实时荧光定量 RTPCR 检测技术， 通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒RNA 的 检测。
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理
一、核酸基本知识
➢ 核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志 ➢ 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA
➢ 所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应 体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时 监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法。
第四代PCR：数字PCR
➢ 由于定量PCR的分析最终结果依赖于Ct值，在这个意义上所谓的“定 量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件 下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“光定量PCR技术的特点
➢灵敏度高 ➢特异性强 ➢快速简便 ➢应用范围广
五、实时荧光PCR的临床应用
➢ 感染性疾病的诊断 ➢ 母婴传播的控制与观察 ➢ 遗传疾病的诊断 ➢ 肿瘤的诊断 ➢ 法医学鉴定 ➢ 早期诊断 ➢ 病情评估和预后判断 ➢ 抗病毒药物疗效的观察、指导 ➢ 新药验证
感染性疾病的诊断
三、PCR技术简介
➢ 高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过 程称为变性。
➢ 变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链， 这一过程称为复性。
➢ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
➢利用温度的升降来控制DNA的变性和复性。 ➢设计引物作为启动序列，加入DNA聚合酶、
dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特 定基因的体外复制。 ➢周而复始的升降温度进行扩增，每一循环 可以使靶序列增加一倍。
PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
➢ 实时荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好
四、实时荧光PCR技术
➢ 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法。
➢ 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检 测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测， 所以有效地避免了样品间的交叉污染。
和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。
➢ Ct值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数。
实时荧光PCR扩增曲线示意图
手工调整荧光阈值示意图
Ct值的意义
Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次
扩增
Ct值与浓度 不同浓度的模板达到荧光域值时
的Ct值不同
PCR扩增的理论模式
➢ Yn=X*(1+E)n ，0≤E≤1，E为扩增效率,X为原 始模板数,Y为PCR产物的分子数量,n为周期数。
核酸的基本结构
遗传信息传递的中心法则
➢ DNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配 对的原则进行半保留复制。
➢ 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR） 是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技 术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大 特点是能将微量的DNA大幅增加。
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
第三代PCR：实时荧光定量PCR
➢ 为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表 达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓“第 三代PCR"的荧光定量实时PCR。
➢ 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合 酶，此酶的发现使PCR广泛的被应用。
➢ 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具 有特异性更强、PCR污染少、自动化程度高等特点， 目前已得到广泛应用。
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
PCR扩增示意图
No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
➢ 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少， 即Ct值越小。
➢ Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷 贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值， 就可以计算出样品中所含的模板量。
标准曲线的建立
梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等， 说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作 误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增 曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因 原始模板量的准确性。