培养细胞常用染色与固定方法
瑞氏染色操作步骤
瑞氏染色操作步骤瑞氏染色是一种常用的细胞染色方法，主要用于观察细胞核形态和染色体结构。
下面将详细介绍瑞氏染色的操作步骤。
一、实验前准备1.1 材料准备瑞氏染色所需的材料有：0.075mol/L KCl、甲醛、乙酸、96%乙醇、苯酚红溶液、甲基绿溶液和天然丝。
1.2 设备准备实验所需的设备有：离心机、恒温水浴器和显微镜等。
二、样品制备2.1 细胞培养首先需要培养好待检测的细胞，使其达到适当生长状态。
在培养过程中，应注意避免污染和过度生长等问题。
2.2 细胞处理将待检测的细胞收集到离心管中，并加入0.075mol/L KCl缓冲液进行离心。
将上清液倒掉，再加入甲醛进行固定处理。
2.3 固定处理将含有甲醛的离心管放置在恒温水浴器中，在37℃下固定处理30分钟，使细胞膜破裂并释放染色体。
2.4 滴定染色将固定后的细胞加入苯酚红溶液，再滴入甲基绿溶液，使染料均匀地覆盖在细胞上。
三、显微镜观察将染好色的细胞片放置在显微镜下进行观察。
可以通过调节显微镜的焦距和光源亮度等参数来获得更清晰的图像。
四、实验注意事项4.1 操作过程中应注意保持无菌环境，避免污染样品。
4.2 在固定处理时，应控制好温度和时间，避免过度固定或过短固定导致样品失真。
4.3 在滴定染色时，应注意均匀地覆盖在细胞上，并避免出现气泡等问题。
总结：瑞氏染色是一种常用的细胞染色方法，其操作步骤包括实验前准备、样品制备、显微镜观察和实验注意事项等方面。
在操作过程中需要注意保持无菌环境、控制好温度和时间、均匀地覆盖染料等问题，以获得更准确的实验结果。
细胞染色方法及原理
细胞染色方法及原理细胞染色是生物学的一个基础技术，它是在光学显微镜下观察和研究细胞形态和结构的重要手段。
细胞染色方法主要有两种：直接染色和间接染色。
直接染色是指将染料直接应用于细胞样本上，以染色剂与细胞内各种成分产生化学反应，使细胞的结构和形态得以显现。
间接染色则是先将染料应用于载玻片上的细胞样本，通过染色剂与样本内成分的亲和性，使样本中的目标分子标记出来，再用荧光显微镜等方法进行观察和分析。
直接染色直接染色法有许多种，其中比较常用的为H&E染色、吉姆萨染色、利伯曼染色、朗格(KOH)染色等。
H&E染色H&E染色是一种组织染色方法，通常用于病理学中观察组织切片的形态和结构。
这种染色方法基于酸性和碱性染料的亲和性，将形态和结构不同的细胞和组织的成分染色成不同的颜色，从而使它们在显微镜下易于区分和观察。
1. 组织切片烘干，清洁去除蜡垢。
2. 组织切片在浓甲醛中进行固定处理。
3. 组织切片在乙醇溶液中逐渐脱水。
6. 组织切片在染色盒中加入碱性染料碧基苏丹、酸性染料伊红，进行染色。
吉姆萨染色1. 细胞的悬液或细胞涂片，经过风干处理。
2. 片上加吉姆萨染色液。
3. 让染色液在室温下静置10-15分钟。
4. 加入相同容量的蒸馏水。
5. 充分洗去染色液。
6. 用红色染色液对细胞进行染色增强。
7. 最后再次漂洗片子。
利伯曼染色利伯曼染色方法基于利伯曼氏液体染色剂在酸性环境下与细胞成分之间的化学反应，此反应使得不同细胞成分在显微镜下呈现不同的颜色，从而可以隔离和观察各种细胞成分。
1. 细胞经过固定处理，去除胆碱酯酶和脂肪酶的影响。
2. 用pH3.5左右的利伯曼氏液体染色剂钙铵液溶解。
3. 细胞片在盐酸中进行处理，形成酸性条件。
4. 细胞片在液体染料中沉浸数小时，使其染色剂物质进入细胞内。
5. 染片在盐酸溶液中进行退色，清洗时间在20-30秒左右。
6. 将片子过水，并以乙醇调制为10%中度酸性溶液。
免疫荧光（IF）细胞化学染色方法
免疫荧光（IF）细胞化学染⾊⽅法免疫荧光（IF）细胞化学染⾊⽅法⼀、标本制作 可制作涂⽚、印⽚、细胞单层培养物、组织切⽚，经适当固定或不固定，作免疫荧光染⾊⽤。
⼆、荧光抗体染⾊⽅法 （⼀）直接法 1．染⾊切⽚经固定后，滴加经稀释⾄染⾊效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗⼈γ-球蛋⽩荧光抗体或兔抗⼈IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染⾊30min，切⽚置⼊能保持潮湿的染⾊盒内，防⽌⼲燥。
2．洗⽚ 倾去存留的荧光抗体，将切⽚浸⼊pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再⽤蒸馏⽔洗1min，除去盐结晶。
3．⽤50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）⽢油封固、镜检 4．对照染⾊ ①正常免荧光⾎清染⾊，如上法处理切⽚，结果应为阴性。
②染⾊抑制试验（⼀步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋⽩或⾎清（相同）等量混合，如上法处理切⽚。
结果应为阴性。
为证明此种染⾊抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可⽤盐⽔代替未标记抗⾎清，染⾊结果应为阳性。
此法结果较⼆步法稳定。
③类属抗原染⾊试验，前⾯已作叙述。
直接法⽐较简单，适合做细菌、螺旋体、原⾍、真菌及浓度较⾼的蛋⽩质抗原如肾、⽪肤的检查和研究。
此法每种荧光抗体只能检查⼀种相应的抗原，特异性⾼⽽敏感性较低。
（⼆）间接法 （1）切⽚固定后⽤⽑细滴管吸取经适当稀释的免疫⾎清滴加在其上，置于染⾊盒中保持⼀定的湿度，37℃作⽤30min。
然后⽤0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，⽤吸⽔吸去或吹⼲余留的液体。
（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗⼈γ-球蛋⽩荧光抗体等），同上步骤，染⾊30min，37℃，缓冲盐⽔洗两次10min，搅拌，缓冲⽢油封固，镜检。
对照染⾊：①抗体对照：⽤正常兔⾎清或⼈⾎清代替免疫⾎清，再⽤上法进⾏染⾊，结果应为阴性。
②抗原对照：即类属抗原染⾊，亦应为阴性。
③阳性对照。
间接法中上述⽅法称双层法（Double Layer Method）。
赫斯特染色步骤
赫斯特染色步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：赫斯特染色是一种广泛应用于生物学和医学领域的染色技术，常用于检测细胞内的DNA和RNA。
赫斯特染色技术可以帮助科研人员对细胞进行观察和分析，从而更好地了解细胞的结构和功能。
本文将详细介绍赫斯特染色的步骤和原理。
赫斯特染色的步骤一般包括以下几个步骤：固定、染色、洗涤和观察。
下面我们将逐步介绍这些步骤。
第一步：固定固定是赫斯特染色的第一步，它是将样本固定在载玻片上，使细胞结构保持原貌，不被破坏。
固定可以使用多种方法，常见的固定方法包括乙醇/冰醋酸固定法、甲醛固定法和乙醇固定法。
在实验中，通常使用甲醛进行固定，因为甲醛可以快速透入细胞并进行交联，固定细胞结构。
第二步：染色染色是赫斯特染色的核心步骤，通过染色可以将细胞核DNA染色为蓝色，细胞质RNA染色为粉红色。
常用的染色剂包括伊姆菲染色剂、哈里斯液、龙与威廉姆斯染色剂等。
在进行染色时，需要将染色剂均匀地加在载玻片上的固定细胞上，然后在适当的条件下进行染色反应。
第三步：洗涤洗涤是为了去除多余的染色剂和杂质，使染色结果清晰明确。
在洗涤的过程中，需要使用PBS缓冲液等，将载玻片放入缓冲液中轻轻摇晃，将多余的染色剂冲走，达到清洗的效果。
第四步：观察最后一步是观察，可以使用显微镜对染色的细胞进行观察和分析。
在观察的过程中，可以通过显微镜观察细胞的形态、大小、染色情况等，从而得出相关结论。
赫斯特染色的原理主要是依靠染色剂对细胞结构的特异性染色。
在染色的过程中，DNA和RNA会与染色剂结合形成复合物，从而呈现出不同的颜色。
通过对这些不同颜色的细胞进行观察和分析，可以更好地了解细胞的结构和功能。
第二篇示例：一、准备材料在进行赫斯特染色之前，首先需要准备好以下材料：1. 染色试剂：包括赫尔曼液、2%盐酸、碘液、碘伊淡液、洗涤液等；2. 玻璃片、载玻片：用于放置染色标本；3. 化学台灯：提供光源；4. 显微镜：用于观察染色结果。
革兰染色的原理和方法
革兰染色的原理和方法
革兰染色是一种常用的细菌染色方法，用于区分细菌的染色特性。
其原理是利用两种染色剂，即靛紫和碘液，与细菌细胞壁的化学组分反应，形成类似靛紫-碘染物的复合物。
革兰染色的方法包括以下步骤：
1. 取一片细菌培养物并固定在玻璃片上。
2. 用碘液滴在细菌上，使之固定。
3. 用靛紫溶液滴在细菌上，使其染色。
4. 将玻璃片在酒精中浸泡，溶解细胞外多余的靛紫。
5. 用洗净的水冲洗干净，干燥后可观察染色结果。
染色后，革兰阳性细菌会呈紫色，因其厚壁的多聚糖、肽聚糖和脂质层能够吸附和保留靛紫-碘染物复合物。
而革兰阴性细菌则不会保留靛紫-碘染物复合物，会在酒精洗涤中脱色，需要再用洗涤液染成粉红色。
革兰染色不仅可以用于细菌的分类鉴定，还可观察细菌的形态特征、大小和细胞结构等。
常用微生物染色方法
原理
一 通透性学说 二 等电点学说
三 化学学说
革兰氏阳性菌含有大量核糖 核酸镁盐，其可与结晶紫-碘 结合成大分子复合物，因而 不易被95％酒精脱色；而阴 性菌中此物质含量较少，因 而吸附染料量很少，分子量 也较小，故易被酒精脱色。
细菌涂片的制备
涂片：取一张洁净载玻片，用已灭菌的接种环取一环 生理盐水于玻片中央，再将接种环灭菌，取菌与生理 盐水磨匀，涂布成1cm×1cm大小区域的均匀薄膜，使 盐水磨成灰白色为宜，接种环灭菌后放回试管架。 干燥：涂片最好在室温下自然干燥或将标本片涂抹面 向上，置酒精灯火焰上半尺高处慢慢烘干。 固定：常用火焰加热法，手执载玻片一端，标本面向 上，迅速来回通过火焰三次。
操作步骤 1、涂片经火焰固定，加石碳酸复红溶液用火 焰微热至出现蒸气约3分钟（防止染液蒸发干， 必要时可续加第一液数滴，水洗。 2、用3%盐酸酒精脱色约1分钟，直至涂片无色 或淡粉红色为止，水洗 3、再加复染液复染1分钟，水洗，干后镜检。 结果判断 抗酸杆菌呈红色，其他细菌及细胞 呈蓝色。
注意事项 1．抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加 标本涂片的厚度，发提高检出率。染厚涂片时， 须掌握复染时间，如果背景过深，会影响镜检。 痰标本找抗酸杆菌，应先高压杀菌，避免实验室 污染。 2．尿、粪中找到抗酸杆菌须作潘氏染色，排除 耻后杆菌，才能报告。 标本中找到抗酸杆菌，须作传染病报告。 3．离心应为3000转/分，30分钟。 4．涂片至少保留三个月。
注意点
⒈取菌量不可太多，涂片应均匀，否则影响染色结果 ⒉干燥时切忌高热，以免细菌变形 ⒊固定时温度不可过高时间不可长，以防涂抹面 烧焦及玻片烧裂
固定的目的
杀死细菌，使菌体蛋白凝固，染料易于着色 改变细菌通透性，以利于染料进入细胞内 使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染 料和水冲掉
实验常用的染色方法
实验常用的染色方法实验常用的染色方法有很多种，下面我将介绍一些常见的染色方法，并附上使用步骤和注意事项。
希望对您有所帮助。
1. 费托染色法费托染色法是一种常用的染色方法，适用于奥林匹克焦磷酸胶原的标本染色。
具体步骤如下：1）将标本放在载玻片上，用甘油将样品漂浮于载玻片表面。
2）将标本置于75%的乙醇中浸泡1分钟，使细胞固定。
3）用氧化锇酸染液浸泡标本1-3分钟，然后将标本漂洗干净。
4）用甘油将标本封闭，并固定封片。
注意事项：- 费托染色法需要使用甘油和乙醇等试剂，请注意安全操作。
- 染液的浓度和时间可以根据样品特性进行调整。
2. 伊氏染色法伊氏染色法是一种常用的细胞和组织染色方法，常用于裂殖原细胞的观察。
具体步骤如下：1）将样品放在载玻片上，并用乙醇固定细胞或组织。
2）将标本漂浸于伊氏染色剂中，染色时间根据需要来确定。
3）用纯水洗涤标本，以去除多余的染色剂。
4）用甘油来固定封片。
注意事项：- 伊氏染色法在染色剂的选择和染色时间上需要一定的经验。
- 染过的载玻片应妥善保存，在显微镜下观察时要注意避免破坏样品。
3. 傅氏染色法傅氏染色法是一种常用的DNA染色方法，常用于荧光显微镜下观察细胞或组织中的DNA。
具体步骤如下：1）将样品固定在载玻片上，并用沙漏酸进行固定。
2）用荧光染料傅氏染料与标本进行染色。
3）用缓冲液洗涤标本，以去除多余的染料。
注意事项：- 傅氏染色法中染料的选择要根据需要进行，不同荧光染料对应不同颜色的发光。
- 染色时间和染料浓度对结果有影响，可以进行优化。
总结：以上是一些常见的实验染色方法，但还有其他多种染色方法，例如格里姆染色法、吉姆萨染色法等。
每种染色方法都有其适用的样本和特点，根据实验需要进行选择。
在进行染色实验时，要注意安全操作和实验条件的控制，以确保实验结果的准确性和可靠性。
染色方法的选择和优化对于正确解读实验结果和实现研究目标具有重要意义。
细胞迁移实验步骤
细胞迁移实验步骤
细胞迁移实验是用来研究细胞在体外条件下迁移能力的实验。
以下是一般的细胞迁移实验步骤：
1. 细胞准备：选择适当的细胞系，通常是癌细胞，培养并扩增足够数量的细胞。
2. 细胞处理：将培养的细胞收集并洗涤，然后根据实验设计的需要，对细胞进行处理，例如加入药物或改变培养基的成分。
3. 迁移装置准备：选择适当的迁移装置，常用的装置有Transwell孔板、Boyden腔等。
按照装置说明进行处理，包括涂覆底部或孔板上的基质和适当的培养基添加。
4. 细胞种植：将处理后的细胞悬浮液加入迁移装置的上室或腔室中，适量加入培养基，然后安放在培养箱中，将细胞孵育一段时间，让细胞附着。
5. 孵育及迁移：将孵育的细胞装置放置在恒温培养箱中，培养所需的时间，等待细胞在上室中迁移至下室。
迁移时间会根据细胞系的不同而有所变化。
6. 细胞固定：迁移结束后，取出迁移装置，将上室液中的细胞去除，固定细胞样本。
常用的固定方法包括用甲醛或甲醋酸乙酯等进行固定。
7. 细胞染色：固定好的细胞样本可以进行染色，例如使用吉姆
萨或其他染色剂对细胞进行标记，以便于观察和计数。
8. 细胞观察与分析：使用显微镜观察细胞迁移的结果。
可以计数迁移至下室的细胞数量，或者通过图像分析软件对细胞迁移的面积或距离进行定量分析。
9. 数据处理与统计分析：根据实验结果，进行统计分析，比较不同处理组之间的差异。
可以使用统计学方法进行数据分析，例如t检验或方差分析。
10. 结果解读与报告：根据实验结果进行结果解读，并将实验内容、方法和结果撰写成科学论文或实验报告。
几种细胞固定方法-细胞固定液选择标准
几种细胞固定方法选择最佳固定液标准是：1最好地保持细胞和组织的形态结构；2最大限度地保存抗原的免疫活性..一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；3不要用可能带有自发荧光的固定剂;如带有苦味酸的固定剂;还有甲醛升汞固定液;会使上皮细胞产生非特异性荧光；4固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果..单纯固定液14%中性甲醛固定液：最常用的固定液;能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作Job..中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的;其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液..此固定液配制后应密封并保存在阴凉处;保存时间不超过一个月..2乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜;具有硬化、固定、脱水等作用;对组织渗透力较弱;因此很少单独使用;但其保存组织中的核酸强于中性甲醛;故常用于有核酸操作的实验或检查;假如用于证实尿酸结晶和保存糖原;可用于100%乙醇固定组织..34%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定..混合固定液1乙醇-甲醛乙醇-福尔马林;AF固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定..该固定液有固定兼脱水作用;固定后的标本可直接入95%乙醇脱水..2B5醋酸钠-升汞-甲醛固定液：多用于固定淋巴组织..染色前应进行脱汞沉淀处理..3Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定..Bouin液对组织固定较均匀;收缩很少;不会使组织变硬变脆..需现配现用..4Carnoy固定液：穿透能力强;可很好的固定细胞质和细胞核;非凡适用于固定外膜致密的组织;也适用于糖原及尼氏小体的固定..5 Zenker固定液：经此液固定的标本;细胞核和细胞质染色颇为清楚;但成本较高且需非凡处理汞..该固定液要避免接触阳光;以免引起化学变化而失效..。
考马斯亮蓝染色的原理和方法
考马斯亮蓝染色的原理和方法原理：考马斯亮蓝染色主要是根据考马斯亮蓝与细胞核DNA之间的特异性亲和力来实现细胞核的染色。
考马斯亮蓝是一种碱性染料，与DNA中的碱基的氮原子形成氢键结合，从而实现染色。
考马斯亮蓝染色过程中，染料进入细胞，通过氢键结合将细胞核染色为深蓝色，而胞质则不受染。
方法：1.固定细胞：首先需要将要染色的细胞进行固定，主要是为了保持细胞的形态和结构，常用的固定剂有醋酸乙酯、甲醛等。
2. 渗透处理：细胞膜对于染料的渗透性较差，因此需要进行渗透处理，使染料能够顺利进入细胞。
一种常用的方法是使用0.1% Triton X-100等表面活性剂进行渗透处理。
3.染色：将考马斯亮蓝染料稀释到适当浓度的磷酸缓冲液中，将固定和渗透后的细胞置于染料中，通常需要15-30分钟的染色时间。
4.洗涤：染色后，需要用磷酸缓冲液进行洗涤，去除多余的染料，保持背景清晰。
5.封片：将染色好的细胞或组织切片置于显微镜片上，加入适量的封片胶和封片玻璃，用修剪片进行封闭，使细胞或组织固定在玻璃片上。
6.观察和拍照：封好片后，使用显微镜观察染色效果，并进行拍照记录或保存。
可以使用显微镜下的目镜或物镜进行观察，也可以使用数字显微镜等设备进行观察和记录。
注意事项：在进行考马斯亮蓝染色时，有一些注意事项需要注意：1.固定细胞的时间应控制好，过短会导致细胞变形，过久则会破坏细胞结构。
2.渗透处理的时间和渗透液的浓度需要根据具体细胞类型和实验要求进行调整。
3.考马斯亮蓝染料的浓度也需要根据具体实验要求进行调整，一般来说，较高的染料浓度会使细胞核染色更深。
4.染色后的洗涤步骤非常重要，可以使用磷酸缓冲液多次洗涤，以确保背景干净。
总结：考马斯亮蓝染色是一种简单有效的细胞核染色方法。
通过与DNA的特异性亲和作用，可以清晰地染色细胞核。
在进行考马斯亮蓝染色时，需要注意固定、渗透、染色、洗涤等步骤的操作，以获得理想的染色效果。
这种染色方法被广泛应用于细胞学和组织学研究领域，为细胞和组织的观察和研究提供了有力的工具。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
培养细胞常用染色与固定方法培养细胞常用染色与固定方法一、普通染色观察苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。
对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。
固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。
固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。
对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min，10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。
（一）HE染色法1.染液配制(1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。
称取0.5g苏木精，5.0g铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。
再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。
混匀。
过滤后即成母液。
可长久保存。
用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用很长时间。
每次染色前宜过滤，去除氧化膜。
(2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。
将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸馏水即成工作液。
2.染色程序（1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。
（2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。
（3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。
此时核呈紫红色。
（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。
如果时间允许，最好用自来水(呈弱碱性)长时间浸泡。
也可入1％NaHCO3溶液。
此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。
（5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。
（6）入伊红染液30s～1 min。
（7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次) 各2min。
如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。
（8）用二甲苯透明2次，各5min。
（9）树胶封固。
3.染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。
如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。
（二）吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。
1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。
（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。
于棕色瓶可长久保存。
需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。
（3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。
吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。
所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。
2.染色程序（1）将标本用甲醇固定5～10min。
（2）入吉姆萨液染色10～15min。
可用染色缸；或将染液滴覆于标本。
（3）蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。
3.染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。
二、玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。
为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。
在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。
能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。
1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。
2、用自来水冲洗5min。
3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。
4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。
5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。
6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。
三、培养物的常用固定方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。
同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.固定组织、细胞的基本原则尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.培养物的准备和固定前处理各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。
对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。
3.常用固定液常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。
主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。
另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。
如Mueller固定液、Flemming固定液、FAA固定液、Carnoy 固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。
不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。
因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。
(1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。
在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。
4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精和其他合成染料染色。
甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。
甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。
用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。
(2)丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮(4℃)固定细胞内酶效果较佳。
(3)乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良。
无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。
乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。
作为固定用乙醇的适宜浓度为70％～100％。
乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。
(4)醋酸：常用0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂。
醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。
醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨胀作用显著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合，所以，常用醋酸来减少其他固定剂引起的细胞收缩。
细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好地保存染色体，还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。
(5)苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水中的溶解度可因水温变化而变化。
苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸。
苦味酸的穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。
它和其他药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬化，而且易于染色。
所以在很多混合固定液中被广泛采用。
作固定用的最适浓度为1％。
(6)锇酸(四氧化锇)：锇酸是一种强氧化剂，不能同乙醇和甲醛混合使用。
它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特别注意。
四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中盛入50～100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.4)，再将装有1g锇酸的安培瓶放人PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用。
常用的固定液浓度为1％～2％。
(7)戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原。
常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1。
表14-1 常用的戊二醛固定液配制方法Ph7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液（ml）96 96 92 90 8825%戊二醛水溶液（ml）4 6 8 10 12戊二醛的终浓度1% 1.5% 2% 2.5% 3%(8)甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂。
甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形态不变。
不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于Giemsa染色(注意：此固定液宜现用现配)。
(9)FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞，固定效果好。
配制方法：90ml 80％酒精中加5ml冰乙酸和5m140％甲醛。
(10)Carnoy固定液：Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液，是显示细胞化学成分(如粘多糖等)时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，适于固定培养的单层细胞。
配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。
(11)Bouin固定液：用于固定双盖片法培养的标本，固定30分钟后，用70％酒精褪去苦味酸黄色，如不立即染色，可将标本保存在70％酒精中。
本试剂适于固定组织细胞的糖原。
配制方法：先将75ml饱和苦味酸(100ml水中加1.2～1.4g)过滤，加入25ml福尔马林(40％甲醛，有沉淀时禁用)，最后加入5ml冰醋酸，混和后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
该固定液对组织细胞穿透力较强，固定效果较好，保存的细胞结构完好。
但因偏酸(pH为3～3.5)，对抗原有一定损害。
(12)4％多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，在50ml蒸馏水中加入4g 多聚甲醛，加热至60～70℃时，边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH，至液体清晰透明。
用1mol/LHCl调节pH 至7.4，冷却后加入0.01mol/LPBS液至100ml，4℃保存。
本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白。