微生物实验技术讲义
《大学课件：微生物学实验技术》
1
菌落计数
学习使用菌落计数法来估算微生物的
培养曲线
2
数量。
了解培养曲线的特点和分析方法，研
究微生物的生长动力学。
3
生长速率
掌握计算微生物生长速率的方法和相 关参数。
常见微生物的培养和鉴定方法
革兰氏染色
掌握革兰氏染色技术，区 分细菌的阳性和阴性特征。
特定培养特性
了解某些微生物的特定培 养特性，如产气、荧光等。
1 增殖速率
了解细胞增殖的原理和 速率控制因素。
2 细胞计数
学习使用显微镜和自动 计数器进行细胞计数。
3 生物量分析
了解生物量分析的方法 和应用，如干重法和荧 光法等。
无菌操作技术
1
消毒与灭菌
学会对培养皿、培养工具和培养基进
传递培养物
2
行消毒灭菌。
掌握无菌操作技术，避免细菌和真菌
的污染。
3
环境监测
了解微生物实验室的环境监测方法和 标准。
纯培养基的制备
琼脂平板制备
液体培养基制备
学习制备琼脂平板和琼脂斜板， 作为微生物培养的基础。
掌握液体培养基的制备方法， 用于大规模培养微生物。
学会正确的洗手、穿戴实验服和佩戴防护设备等个人卫生常识。
4 废物处理
了解废物处理的规定和流程，保护环境。
微生物实验室的安全与保护
生物安全级别
了解微生物实验室的安全 级别分类，确保实验室的 安全性。
防护措施
学习使用防护设备和采取 预防措施来保护自己和实 验环境。
危险物质处理
熟悉处理危险物质的方法 和相应的应急措施。
生物化学测试
学习常见的生物化学测试 方法，如氧化-发酵试验等。
微生物学实验讲义
实验二实验器具的灭菌一、实验目的1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。
2.了解其他灭菌方法。
二、基本原理高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。
其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
三、器材1、高压蒸汽灭菌锅2、牛皮纸3、棉绳4、仪器和其他用具四、操作步骤1、包扎将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。
2、加热烧开待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。
3、升压完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。
4、减压，取出器具到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。
当压力降到零后，才能开盖。
五、思考题（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制—、目的要求1、明确培养基的配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0gNaCI 5.0g水1000mIpH 7.4～7.6三、器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。
2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。
微生物学实验技术（研究生）
微⽣物学实验技术（研究⽣）⾷品微⽣物实验技术讲义（硕⼠研究⽣⽤）⾷品科学与⼯程学院微⽣物学实验技术的体系具有独特性：需要独特的实验室装备和独⽴的训练技术包括：显微镜术和制⽚染⾊技术、⽆菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。
第⼀章微⽣物的纯培养和显微技术计划学时：2重点：微⽣物的分离和纯培养技术，常⽤的菌种保藏⽅法。
细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。
⼤多数动物植物的研究、利⽤都能以个体为单位进⾏，⽽微⽣物由于个体微⼩，在绝⼤多数情况下都是利⽤群体来研究其属性，微⽣物的物种（菌株）⼀般也是以群体的形式进⾏繁衍、保存。
在微⽣物学中，在⼈为规定的条件下培养、繁殖得到的微⽣物群体称为培养物（culture），⽽只有⼀种微⽣物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利⽤和重复结果，因此把特定的微⽣物从⾃然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进⾏微⽣物学研究的基础。
相应的，微⽣物个体微⼩的特点也决定了显微技术是进⾏微⽣物研究的另⼀项重要技术，因为绝⼤多数微⽣物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进⾏观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等⽅⾯的内容。
实际上，正是由于显微技术及微⽣物纯培养技术的建⽴才使我们得以认识丰富多彩的微⽣物世界，并真正使对微⽣物的研究发展成为⼀门科学。
第⼀节微⽣物的分离和纯培养⼀、⽆菌技术微⽣物通常是⾁眼看不到的微⼩⽣物，⽽且⽆处不在。
因此，在微⽣物的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“纯洁”，防⽌其他微⽣物的混⼊。
在分离、转接及培养纯培养物时防⽌其被其他微⽣物污染的技术被称为⽆菌技术（aseptic technique），它是保证微⽣物学研究正常进⾏的关键。
实验课6 ——【医学微生物学精品讲义】
TRUST (toluide red unheated serum regain test)
材料：TRUST试剂盒、病人血清
反应卡
1
2
3
Positive Negative Experimental control control group
（4）复染：稀释复红30sec，水洗，甩干水份。
（四）浅部真菌病标本的检查
1. 实验材料 （1）发癣或足癣患者的毛发或皮屑。 （2）10～20%NaOH溶液。 （3）载玻片、盖玻片等。
奋森螺旋体(革兰染色)
梅毒螺旋体(镀银染色)
钩端螺旋体(镀银染色)
暗视野显微镜下苍白密螺旋体 （暗视野，放大1000倍）
（二）梅毒血清学诊断试验
非螺旋体抗原试验：查反应素，特点是敏感性高, 但 易出现假阳性。 反应素是指非特异性抗类脂质抗体。当苍白螺旋体侵 入人体后,便会诱发人体产生两种相对应的抗体,即具 有种和属特异性的IgM和IgG抗体,另一种是非特异性抗 类脂质抗体称为反应素，它不是由螺旋体所产生而是 在螺旋体破坏人体组织过程中所释放的物质间接产生 的这种具有抗体特性的物质称为反应素。这种抗体主 要是IgE。
操作程序：
1. 将待检血清及TRUST抗原于试验前置（23-29℃）中平衡 片刻。
2. 分别吸取阴性和阳性对照各1滴（50μl）加到反应卡的二 个圆圈内并铺匀。
3. 吸取待检血清或血浆（不需灭活）1滴，分别滴加于卡片 上的另一个圆圈内并铺匀。
4. 轻轻摇匀抗原，用专用滴管针头垂直滴加抗原各1滴于 圈内。
真菌
（一）真菌的形态
真菌（fungi）大多为多细胞，仅少数为单细胞。单细 胞型真菌呈圆形或椭圆形，如酵母菌或类酵母型真菌。
微生物学实验讲义
微生物学实验讲义（2008级基地班）任课教师：熊芳教授教化时数：15学时实验周数：4周生物学实验教授教化中间微生物实验目次（15学时）微生物实验差不多常识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：泥土自生固氮菌的分别纯化（5学时）实验三：显微镜的应用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验差不多常识一、实验目标1.熟悉实验室规矩和安稳守则，精确应对实验中显现的不测变乱；2.熟悉微生物学实验室常用仪器和有关试剂的全然常识；3.操纵实验申报的精确书写。
二、实验内容1.实验室规矩；2.实验室安稳守则；3.实验室中不测变乱处理；4.常用器皿及器具；5.显微镜及有关常识；6.实验预习、实验记录和实验申报。
实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌设备培养基的全然流程如下：原料称量→消融→调剂pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、养分成分1. 依照不合微生物的养分须要配制不合的培养基，如自养型微生物的培养基完全能够（或应当）由简单的无机物质构成。
异养微生物的培养基至少须要含有一种有机物质。
碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体供给全部心理活动所须要的能量（异养微生物）。
氮源(nitrogen source) 凡是供给微生物养分所需的氮元素的养分源，称为氮源。
氮源物质的重要感化是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能应用铵盐、硝酸盐作为机体进展的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的前提下，也能够应用氨基酸作为能源物质。
能源指能为微生物的生命活动供给最初能量来源的养分物或辐射能。
2. 留意各类养分物质的浓度与配比养分物的浓度：在一样情形下，浓度合适的养分物质才对微生物表示出优胜感化，浓度大年夜时对微生物进展起克制造用，浓度小时不克不及知足微生物进展的须要。
各养分物质之间的浓度比：培养基中各养分物质之间的浓度比直截了当阻碍微生物的进展与滋长和（或）代谢产品的形成与积聚，专门是碳氮比（C／N）（碳氮比一样指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的阻碍更为明显。
微生物实验讲义-参考写实验报告
吉林农业大学讲义（2011-2012 第一学期）动物微生物学实验课程学时：18学时任课班级：7105（2）-1,2专业：经动专业任课教师：胡静涛吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学教研室动物微生物学实验部分一、课程的性质和任务动物微生物学实验是动物医学、经济动物养殖及动物科学专业重要的专业基础实验课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。
熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。
无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容。
课程任务：1.动物微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与动物疾病及动物生产有关的微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。
2.与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。
3.提高学生分析问题和解决问题的能力。
根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。
二、教学要求与教学方法1.教学要求（1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高；（2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；（3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；（4）对实验结果进行仔细观察和认真记录，并进行科学分析，得出恰当结论。
（5）独立认真完成实验报告，书写实验报告要字迹清楚，语言简练，表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。
（6）树立密切合作的风气，包括学生与老师、组与组、组长与组员之间的紧密配合。
（7）切实遵守实验室规则。
2.教学方法（1）以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；（2）对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有机结合；（3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意识；（4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。
微生物学实验技术
微生物学实验技术
微生物学实验技术是研究和发掘微生物的重要方法，也是一门多种实验技术和方法的
综合。
它既可以应用于生物体内，对微生物调查，可以使用培养基或特定介质进行鉴定，
也可以用来通过遗传工程分离、改造微生物，了解不同微生物的全部 trait 特性。
一、培养微生物
培养微生物是一种最常用的微生物实验技术，需要使用特定的培养基，通过控制温度、湿度等变量的变化来培养不同的微生物。
通过检测培养基中的微生物数量及某些代表性特征，可确定微生物的分类特征，来鉴定微生物的种类和形式。
二、基因组测序
基因组测序是一种实验技术，是分析一个微生物种类全部 genetic 的方法。
主要利
用高通量DNA测序技术，对样品中贮藏的 DNA 进行范围检测，得到 DNA 的测定序列，从
而确定微生物的遗传结构、物种种类，以及特定物种生态和功能特征。
三、共价法抗菌药敏试验
共价法抗菌药敏试验是研究微生物对一类药物或多类药物的抗性程度的重要方法之一。
通过检测药物剂量的不同，在药物浓度相同的情况下微生物在某种时间内生长情况不同，
来确定微生物对某种药物或多类药物的抗性情况。
四、特异性提取
特异性提取是一种以特定方法从微生物中提取出特定“ biomolecule ”，比如 DNA、蛋白质等，分离和纯化微生物某功能元件或特征分子的实验技术。
这种技术既可以提取大
量的基因片段，也可提取微量的特异性物质。
五、遗传修饰
遗传修饰是一种利用遗传工程改造或添加微生物特定遗传物质来改变微生物的特性的
实验技术，常用来进行分子育种和改良育种，以提高产品的质量和性能。
微生物实验讲义
微生物学实验讲义绪论实验课的目的与要求1.普通微生物学实验的目的掌握微生物的基本操作技能, 了解微生物学的基本知识；加深对课堂理论的理解。
同时培养同学认真观察思索、分析解决问题的能力和严肃认真的科学态度。
2.普通微生物学实验课的要求a、实验预习了解实验的目的和原理, 做到每一步实验都心中有数。
b、实验观察和记录微生物实验的连续性较强, 实验中也较常出现突发情况, 所以要求同学认真细致观察, 如实记录。
c、实验结果要求同学实事求是地填写实验结果, 交给老师评阅。
d、爱护公共财物并维护公共秩序:公用的仪器药品用后放回原处。
对精密仪器（显微镜、天平）细心维护, 轻拿轻放。
从冰箱或温箱取放物品时要随时关门。
对消耗性的材料、用品、药品要厉行节约（擦镜纸、滤纸条等）。
3.实验室规则微生物实验不同于动、植物实验, 我们会经常接触到一些致病菌或条件致病菌, 所以希望大家严格遵守无菌操作, 为保证自身及他人的健康, 以防污染或感染。
a、实验室的整洁非必需书、物品请勿带入实验室, 不得在室内吸烟、进食, 实验后收拾、擦净桌子。
b、实验时的需小心如遇到盛菌试管打破或皮肤破伤要及时处理。
c、实验培养的材料标明自己的组别、处理方式, 放入教师指定地点培养。
d、实验后的灭菌所用物品可进行3%来苏水浸泡消毒或高压灭菌。
e、实验前后工作之前先洗手, 工作后用肥皂洗手。
f、离开实验室一定关闭、水、电、门、窗。
第一部分微生物的染色与形态结构的观察基本原理: 虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征, 但其应用有局限性；用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构, 但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂, 应用上也受一定限制。
所以, 一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。
然而, 微生物（尤其是细菌）细胞小而透明, 当把细菌悬浮于水滴内, 用光学显微镜观察时, 由于菌体和背景没有显著的明暗差, 因而难以看清它们的形态, 更不易识别其结构, 所以, 用普通光学显微镜观察细菌时, 往往要先将细菌进行染色, 借助于颜色的反衬作用, 可以更清楚地观察到细菌的形状及其某些细胞结构。
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开课编号：513041Y微生物学实验技术Experiment of Microbiology课程编号：S071005ZY009课程属性：专业课学时/学分：60/1预修课程：微生物学、生物化学、普通生物学、遗传学教学目的和要求：本课程为微生物学专业研究生专业课，也可作为相关专业研究生的选修课。
通过本课程的教学，训练学生掌握微生物学的操作技能；进一步了解、深化微生物学的基本理论，加深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识，同时通过实验，培养同学观察、思考、分析问题和辩证思维能力，为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。
实验一微生物实验综合介绍（8h）（刘利新）1．微生物学实验室安全操作规程讲解本部分内容将参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）,该《准则》于2003年8月1日实施。
规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、实验室的分级及其基本要求。
本节课将对其中内容进行选择性讲解，期望对新入实验室的学生规范化管理起到积极的促进作用。
2．微生物实验设备综合介绍3．细菌、放线菌分离培养基的制备为保证下节实验课的顺利进行，本次实验课将配制细菌、放线菌分离培养基。
详细步骤参见实验二中培养基制备。
实验二从自然界分离筛选微生物菌种（8h）（戴欣）一、实验目的掌握环境样品微生物分离培养的基本方法，并对分离得到的微生物进行初步分类鉴定二、实验原理自然界中存在着各种各样的微生物，可以通过人工培养基提供微生物生长所需要的营养物质，将其中部分微生物从环境中分离出来。
不同的微生物对营养要求有很大的差别，明确这一点非常重要。
培养基配制的基本原理是人工地将多种营养物质按照各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养物质，一般包括碳源、氮源、无机盐和水。
由于微生物无处不在，因此培养基在使用之前必须灭菌。
对于大部分培养基而言是可以通过高压湿热灭菌来实现。
由于微生物核糖体小亚基RNA基因功能稳定、分布广泛且由高变区和保守区相间组成，是目前广泛应用的微生物分子分类鉴定标准。
本实验通过对微生物的16S rRNA基因序列分析从而对其进行初步分类鉴定。
三、实验内容及步骤1.细菌、放线菌分离培养基的制备培养基配制的基本步骤：1)先在空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水2)称量培养基各组分3)溶化各组分，如需要可搅拌或加热4)调pH，定容5)分装。
如需配制固体培养基可加入1.5%琼脂粉6)高压蒸汽灭菌：一般选择121℃/20min，但如果培养基中有葡萄糖类物质应选择115℃/20min。
R2A培养基（细菌用）：酵母提取物：0.5g；蛋白胨：0.25g；酪氨酸：0.75g；葡萄糖：0.5g；淀粉：0.5g；磷酸氢二钾：0.3g；硫酸镁：0.024g；丙酮酸钠：0.3g；加水稀释至1L，调节pH至7.5-7.8，琼脂15g，115℃灭菌20分钟后倒平板；GYM培养基（放线菌用）：酵母提取物：4g；麦芽糖：10g；葡萄糖：4g；碳酸钙：2g；加水稀释至1L，调节pH 至7.5-7.8，琼脂15g，115℃灭菌20分钟后倒平板。
2.样品的采集和保存采集用具和样品放置容器严格灭菌处理，防止样品污染。
微生物分离培养样品短期可4℃保存，长时间存放最好冷冻保存。
3.微生物分离培养微生物的分类培养要特别注意无菌操作，无菌操作基本环节如下：1) 接种室或超净台要保持清洁，用前使用紫外灯灭菌2) 接种的试管、三角瓶等要做好标记，避免弄混。
接种使用的枪尖等要做灭菌处理3) 接种前双手要用70%酒精消毒，并避免直接接触样品4) 培养箱注意清洁，并经常消毒首先根据对样品中微生物生物量的估算，按梯度稀释样品，一般制备原液、10-1~10-7稀释液；如果样品生物量较低，也可选择浓缩样品或经液体培养基富集培养样品中的微生物；然后取100ul稀释（或浓缩）样品液或富集培养物涂布于分离培养基上，28℃（或样品采集环境温度）倒置培养3~5天。
特定微生物的分离培养：根据微生物的营养需求选择性添加营养元素来富集特定微生物、模拟微生物的特定生境（如人工海水或者高温、低温培养）、利用微生物的某些降解活性（如纤维素降解活性）分离特定微生物等4.微生物菌株纯化与保存将长出的菌株挑取在新的培养基上进行划线纯化，一般重复2-3次以上；将纯化后的菌株可转至试管斜面培养后置于4℃短期保藏，也可经液体培养后添加保护剂（甘油、二甲基亚砜、脱脂奶粉等）置于-20℃或-80℃长期冻存。
5.纯化菌株的（分子）鉴定首先对得到的菌种进行液体培养至对数生长期，离心收集菌体，采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌的总DNA。
然后使用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，扩增条件：94℃4min, 94℃1min,55℃1min, 72℃2min, 30个循环后72℃10min，至4℃停止。
PCR产物经电泳检测和PCR产物纯化试剂盒纯化后送公司测序，通过BLAST将获得的序列与GenBank数据库中序列进行相似性比对，初步鉴定菌种的类群。
16S rRNA通用引物如下：27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC 3'实验三厌氧微生物的培养（8h）（佟卉春）一、实验目的熟练掌握微生物的厌氧培养方法；观察菌体、菌落形态特征，并测定其生长曲线。
二、实验原理厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。
通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
目前培养厌氧微生物的技术包括：亨盖特厌氧滚管技术，厌氧手套箱培养技术，及厌氧罐/袋培养技术。
三、试剂与器材1.器材：普通光学显微镜，需配100倍放大的物镜，恒温培养箱，可见光分光光度计，超净工作台，制冰机，恒温水浴锅，电磁炉，医用瓷托盘：25cm X 16cm，载玻片（最少每人1张），一次性1ml注射器（大约300支）1ml比色皿（玻璃材质即可，每组或每人一个），厌氧管及配套塞子：500支，2.5L厌氧培养罐：5只，适用于2.5L厌氧培养罐的厌氧产气袋：1包，每包10只，直径9cm标准培养皿（最少80只）2.试剂：革兰氏染色试剂（应最少可染30张片子），BHI肉汤（Difco公司）：500克国产琼脂：500克，75%酒精棉球四、实验内容及步骤以链球菌为例，进行纯度检查，厌氧培养及生长曲线测定。
1.纯度检查：涂片、革兰氏染色、及显微镜下观察细菌形态及纯度。
2.接种及厌氧培养：1）预还原无氧培养基制备（演示）：培养基配制；分装，3ml/管；抽气换气法制造厌氧环境：先用真空泵抽成负压99.99kPa（750mmHg），然后充入无氧氮气，反复4次，最后充入80%N2、10%H2和10%CO2的混合气体；高压蒸汽灭菌。
2）接种及厌氧培养：将过夜培养的链球菌以1：20的比例接种到新鲜的预还原的厌氧培养基中，37℃温箱培养，每隔1小时取1ml样品，用分光光度计测定其在600nm处的光吸收值，记录并绘制生长曲线。
3.Hungate厌氧滚管1）实验菌种系列稀释：将实验菌种10倍系列稀释。
用无菌注射器吸取1ml 原液至另一支装有9ml培养基的试管中，制成10-2稀释液。
按此操作方法依次进行10倍系列稀释，制成不同浓度的样品稀释液。
取适宜稀释度的样品进行厌氧滚管。
2）厌氧滚管：将预先配制的装有2.7ml无氧琼脂培养基的试管置于沸水中融化，放置于55℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取适宜稀释度的稀释液各0.3ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
2）37℃温箱培养，24小时后观察并记录菌落形态。
4.厌氧罐培养1）实验菌种系列稀释：将实验菌种10倍系列稀释，取适宜稀释度的样品涂布平板。
2）将平板置于厌氧罐中，厌氧罐由透明的聚碳酸酯或不锈钢制成，盖子内侧有金属网状容器，用于装厌氧指示剂美蓝和用铝箔裹封的催化剂钯粉。
然后将气体发生袋放入容器密封后，容器内的氧气在0.5~1小时内被完全吸收，同时产生等量的二氧化碳。
3）37℃温箱培养，24小时后观察、记录菌落形态，并计数菌落数目。
实验四生长谱法选育营养缺陷型菌株（8h）（何秀萍）一、实验目的理解营养缺陷型菌株的选育原理及用途，掌握筛选营养缺陷型菌株的方法。
二、实验原理营养缺陷型菌株是指由于基因水平上的变化，使细胞缺失有功能的某种蛋白质（多数为酶），造成代谢途径的阻断，不能合成某种必需的代谢产物，只能在营养丰富的完全培养基或外源添加被阻断合成的物质的基本培养基中正常生长的一类菌株。
利用物理、化学或生物学手段使特定代谢途径中关键酶基因发生突变，并结合有效的筛选方法，就可以获得特定的营养缺陷型菌株。
营养缺陷型菌株被广泛应用于代谢调控及代谢工程改造中解除反馈抑制，使中间产物或分支途径中终产物大量积累，如氨基酸、维生素、核苷酸等。
同时营养缺陷型也是遗传学研究、传统微生物育种技术（细胞杂交和原生质体融合）及基因工程中应用最为广泛的遗传筛选标记。
三、实验内容及步骤1、实验材料(1) 菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(2) 培养基及试剂酵母菌完全培养基(YPD)：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，溶于蒸馏水，自然pH。
配置固体培养基需加入1%琼脂粉。
8磅灭菌30min；酵母菌基本培养基(SC)：0.67% (Yeast Nitrogen Base, Difco)，1%葡萄糖，溶于蒸馏水，自然pH。
配置固体培养基需加入1%琼脂粉。
8磅灭菌30min；其他试剂：0.25 g/L尿嘧啶、1g/L色氨酸、0.35g/L组氨酸、0.3g/L亮氨酸、0.3g/L赖氨酸。
2、方法和步骤(1) 诱变后菌液处理：诱变后细胞悬浮液进行10倍的梯度稀释，然后涂布在YPD固体培养基平板上，30℃温箱培养48 h；(2) 营养缺陷型突变株的检出：将YPD平板上长出的单菌落挑到装有1ml无菌水的小试管中制成菌悬液，室温静置4 h；分别取一接种环菌悬液点接于SC和YPD固体培养基上，30℃温箱培养48 h；在YPD固体平板上能够生长，在SC固体平板上不能生长的就是可能的营养缺陷型菌株；(3) 营养缺陷型的鉴定：通过在基本培养基SC中补充不同的营养元素，检测细胞生长情况，确定突变菌株具体缺失了那种物质的合成能力。
一般先进行大类的鉴定，如氨基酸、核苷酸或维生素等营养缺陷型；然后对大类内部各物质缺陷型进行具体的鉴定。
营养缺陷型大类的鉴定：将可能的营养缺陷型细胞转接到无菌水中，5000 rpm离心5分钟离心收集细胞，用无菌水洗两次，重悬于无菌水中，使细胞浓度约为106个/ml，取1ml 菌悬液，与融化后冷却到45-50℃的15 ml SC固体培养基充分混合，倒入培养皿中，凝固后，将培养皿底部划分为三个区域并做标记，然后在平板里的三个对应区域分别贴上蘸有氨基酸混合液、维生素混合液、碱基混合液的滤纸片，30℃温箱培养48 h，根据在滤纸片周围是否出现微生物生长圈，确定突变株属于哪一大类的营养缺陷型；营养缺陷型的具体确定（以氨基酸缺陷型为例）：按照每次缺少一种氨基酸的策略，制备含有不同氨基酸组合的SC固体培养基平板；将YPD斜面上培养的细胞接一环于无菌水中，室温静置4 h，然后将菌悬液分别对应点于上述不同的固体平板上，30℃温箱培养48 h，在缺少了某种氨基酸的培养基上不能生长的突变株即为该氨基酸的营养缺陷型菌株。