血疟原虫检检查标准操作规程
疟原虫检验专业技术标准
A typical Plasmodium vivax presentation
A thin film from a 22 year old male holidaying in Lombok (Indonesia) one month previously. Intermittent fevers since returning.
5. 核可能出 现在环状 体边缘
6.
卵形疟（P. ovale）诊断要点
1. 红细胞涨大
2. 常见慧星状 ( 也称齿轮状)
3. 环粗大
4. 薛氏点明显
5. 成熟滋养体类 似三日疟原虫 但更粗大
6. 成熟裂殖体约 含4-12个裂殖 子
7.
种
周 围 血 红细胞形态
疟原虫形态
中发育
阶段
大小
点彩
胞浆
疟色素
恶性疟 P.falciparum
● 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病
● 我国流行区域为云南省和海南省
● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及 生命
间日疟 P.vivax
● 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见
● 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区 ● 病程良性, 有复发
间日疟（P. vivax ）鉴定要点
红细胞通常涨大
薛氏点明显
成熟环状体粗大
滋养体胞浆有阿米 巴样伪足
血片中可见各期的 原虫形态
成熟裂殖体约含1224个裂殖子
疟原虫检验技术(5)
疟原虫检验技术梁平县疾病预防控制中心何曦血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足心影响检查的结果，必须把握好“三关”，即制片、染色和镜检。
一、玻片清洁玻片清洁。
清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。
在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染污玻片。
1.新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。
2.使用过的载玻片的清洁方法有两种：①5%的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，用清洁干毛巾擦净后待用。
②清洁液浸泡法：清洁液配制如下：重铬酸钾 80g浓硫酸 100ml水(清净水)1000ml配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。
清洁玻片时，将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。
浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。
二、制片1.薄血膜涂制：(1)先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。
(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。
(3)取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。
血量1-1.5mm3 .1/4.火柴头大小。
(4)将推片臵于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。
涂制得较好的薄血膜只有一层血球，血球的分布排列比较均匀，血膜的末端突出如舌状。
若取的血滴太大，则涂制的血膜太宽太厚；若推时用力不均匀，则易成梯田状，若用力太大，则血膜两端过厚，若涂片上有油污，则血膜成多孔状。
血疟原虫(薄血片法)1
12.3薄片油镜检查，须找出100或100个以上视野才能报告“未检出疟原虫”。
12.4找到环状体后，须再仔细寻找更为成熟的阶段，以便分类。如确实未找到更为
成熟阶段的疟原虫，可报告为“检出环状体疟原虫”。
12.5有可能出现2种或3种疟原虫混合感染时，以间日疟与恶性疟原虫混合感染
..环状体..
虫体大小较大，
约为红细胞的1/3
较大，
约为红细胞的1/3
较小，
约为红细胞的1/6
细胞浆浅蓝色，
呈较薄之环状
浅蓝色，
呈较厚之环状
浅蓝色，环状较细薄，常位
于细胞之边缘，有时1个细
胞内有2个环状体
染色质可长得很大，甚至充
满整个红细胞
与间日疟原虫同红色小点，1个环状体具有
1-2个-或更多
养体
晚期滋
为常见，须注意鉴别。
裂殖子形
态
排列不规则排列不规则或呈花
朵状
配
虫体大小圆形，
约为红细胞1/2以上
圆形，与红细胞等大
或较小
半月形，两端钝圆（雄），
两端较尖（雌）
子
细胞浆深蓝色深蓝色蓝色
母体
染色质结实，深红色，
位于一边
结实，深红色，
位于一边
结实，深红色，
位于中央
疟色素沿边分布沿边分布黑褐色，密集于中央
红细胞胀大，色较淡正常或缩小正常，偶然缩小，色深
8.临床意义：本实验用于对疟原虫的形态进行鉴别分类。
9.操作性能：快速简便、操作简单。
10.方法局限性
10.1阳性检出率较低。
10.2存在主观判断的失误。
11.参考文献
疟原虫检测血涂片镜检法
疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法ICS11.020C62WS 中华⼈民共和国卫⽣⾏业标准WS/T 569—2017疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites2017-08-01发布2018-02-01实施前⾔本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准起草单位：海南省疾病预防控制中⼼、江苏省寄⽣⾍病防治研究所、中国疾病预防控制中⼼寄⽣⾍病预防控制所、云南省寄⽣⾍病防治所、海南省农垦总局医院。
本标准主要起草⼈：王善青、⾼琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李⾬春、刘莹、欧阳范献。
疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法1 范围本标准规定了⾎涂⽚镜检法检测疟原⾍的技术规范。
本标准适⽤于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原⾍的显微镜检测。
2 术语和定义下列术语和定义适⽤于本⽂件。
2.1疟原⾍Plasmodium spp疟原⾍是⼀类单细胞、寄⽣性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。
寄⽣于⼈体的疟原⾍主要有恶性疟原⾍（Plasmodium falciparum）、间⽇疟原⾍（Plasmodium vivax）、三⽇疟原⾍（Plasmodium malariae）和卵形疟原⾍（Plasmodium ovale）等。
2.2⾎涂⽚ blood films将⾎液涂制于载玻⽚上制成的涂⽚。
供显微镜疟原⾍检查⽤的⾎涂⽚包括厚⾎膜涂⽚和薄⾎膜涂⽚两种。
3 仪器和器材3.1 ⽣物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×⽬镜）。
3.2 计数器。
3.3 载玻⽚（⽆划痕⽆油污的洁净载玻⽚）。
3.4 推⽚。
3.5 ⾎⽚染⾊架。
3.6 ⾎⽚⼲燥架。
3.7 玻⽚盒。
3.8 染⾊盘和染⾊缸。
4 试剂和材料4.1 吉⽒染⾊原液。
4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
4.3 甲醇（分析纯）。
4.4 ⾹柏油或专⽤浸油（折射率≥1.5）。
疟原虫检测标准操作程序
疟原虫检测检测标准操作程序1. 检验目的与原理1.1检验目的：检查血液中是否有疟原虫。
1.2 检验原理：瑞氏染色原理：瑞氏染料中含有美蓝和伊红两种染料，前者为碱性，后者为酸性，它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调，以便于辨认。
根据瑞氏染色的酸碱物质染色性不同，可讲疟原虫各期的形态进行清楚染色，便于观察，高倍镜下一般可以观察到各种类型的疟原虫（常见间日疟、三日疟、恶性疟），疟原虫的各期，如环状体（早期滋养体），晚期滋养体，裂殖体、配子体等。
2. 样本收集和贮存2.1原始样本系统：全血。
2.2标本类型：EDTA抗凝血2ml,标本的采集应使用标准一次性采血管，充分混匀，勿震荡。
2.2保存条件：EDTA抗凝血尽快即时检测。
2.4病人要求：必须是发烧时采血。
3．试剂3.1瑞氏染液：3.1.1试剂成分：瑞氏染料 1.0g无水甲醇500ml甘油10ml3.1.2瑞氏染液配制方法：将瑞氏染料称量好后，放在乳钵中加少量无水甲醇匀速研磨至溶解，将研磨好的染液倾倒入试剂储存瓶中，倒入无水甲醇继续研磨，反复多次，直至乳钵中无瑞氏染料沉淀为止，染液试剂瓶存满为止。
将配制好的染液放在37℃24小时后方可使用，放在阴凉干燥处，避光保存。
3.2磷酸盐缓冲液PH6.43.2.1 脱水Na2HPO4 1份: 处理方法将Na2HPO4于蒸发皿上干燥(火燃烘烤）成粉末称量。
3.2.2无水KH2PO4 2.6份将脱水Na2HPO4 1份和水KH2PO4 2.6份充分混合，边研磨边混匀。
3.2.3将上述粉末1g加溶解于500ml去离子水中，混合均匀，方可使用。
3.3 器材：载玻片、加样枪、吸头、推片器4. 仪器显微镜 OLYMPUS 型号：CX21。
4.1开机前检查4.1.1 OLYMPUS显微镜：检查显微镜光路系统，目镜、物镜镜头正常，聚光器、光圈、螺旋、微螺旋调节正常。
4.2日维护：每日清理纤维镜表面，保持显微镜光圈、聚光器干净整洁；每日下班前无水乙醇（二甲苯少用，有致癌性）清洗所有显微镜物镜（低倍镜10，高倍镜油镜）、目镜。
疟原虫检验专业技术标准
质量好的染色 : 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
外观吉氏染色血片
偏酸 标准 偏碱
染色过程
血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜 血片平置于染色板上 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min 清水细缓轻轻冲去染液 置玻片于插板上，自然晾干然会影响血片制作和镜检结 果．
● 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 ● 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚血膜脱落. ● 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检
质量．
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法：
● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) ● 半定量计数法 (厚血膜) ● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
取血部位和血量
取血方法 采血部位：耳 垂或无名指，通常在耳垂 取血，先用75%酒精棉球 消毒取血部位，待酒精干 后，用左手拇指和食指紧 捏耳垂上方或无名指指尖， 右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然 后用右手中指轻轻挤压出 血。厚血膜血量约一粒米 大小。
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量 （相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成 直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术1）薄血膜（thin blood film）制作方法（1）采血：临床上取病人耳垂或指尖血（2）操作方法：取病人末梢血1滴，置载玻片的中部，使推片和玻片保持30～40度夹角，将血滴在推片边缘展开后，匀速向前推动，即形成舌状血膜。
2）厚血膜（thick blood film）制作方法（1）采血同薄血膜法（2）操作方法：厚血膜可置于薄血膜的另一端。
取病人末梢血2-3滴，自里向外顺着一个方向徐成直径约1cm大小，厚薄均匀的血膜。
厚、薄血膜间用蜡笔画线分开。
充分晾干后，滴加蒸馏水于厚血膜上溶血，将水倾去，晾干后与薄血膜一起染色。
3）固定、染色（1）瑞氏染色：先用蜡笔在血膜两端划上线，以防染液外溢。
瑞氏染液为甲醇溶液，血膜不需预固定、此染色法快速，适于临床检验，但较易褪色，保存时间不长。
滴加瑞氏染液数滴，使之覆盖血膜，约1～2min后血膜被染液中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀，3～5min后用缓冲液或自来水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。
4）注意事项(1）玻片要洁净，无油脂。
血量适中，推速均匀，以防血膜过厚、过薄或出现条状横纹。
血片在干燥过程中，避免灰尘或苍蝇脱吸。
(2）厚薄皿膜制备在一张载玻片时，应注意在厚血膜溶血前必须先用甲醇固定薄血膜，以避免接触水而使薄血膜上的红细胞溶解。
厚血膜溶血时间不可太长，不要振荡，以防血膜脱落。
(3）染液是甲醇溶液，切忌混入水滴，否则发生沉淀，妨碍染色，故染液发现有沉淀时不可再用。
(4）滴加染料切忌太多，否则染料残渣粘在血膜上无法洗净，影响检查。
加水后必须与染料充分混合，否则发生染色不均。
冲洗血膜时应流水直接将染液冲去，避免染料粘着血膜。
疟原虫(MP)厚血片检查法(手工法)的标准操作规程
疟原虫镜检血片制作与染色操作流程
1．填写登记表在“疟疾发热病人血检登记本”上为患者编号并登记其相关信息。
2．清洁玻片
3．玻片编号用目测法将玻片分成六等分，左侧第一和等二等份用于编号。
同一患者玻片上号码应与登记本上一致。
4．采血
5．涂制厚厚片
（1）血量: 4～5微升
（2）位置：玻片第三等份中央的位置
（3）血膜大小：0.8～1.0厘米
6．涂制薄血膜
（1）血量: 1～1.5微升
（2）位置：玻片第四至第六等份的位置。
涂制薄血膜的血应滴在玻片中央稍偏右的位置
（3）血膜大小：2.0厘米(宽)×2.5厘米(长)
7．吉氏染色液配制
（1）2%的吉氏染色液配制方法98毫升蒸馏水加入2毫升吉氏原液，混匀后即为2%的吉氏染色液。
也可用1支试管，按1毫升蒸馏水加入1滴吉氏原液的比例稀释染液，混匀后用于染色。
（2）注意事项2%的吉氏染色液必须现配现用。
8．吉氏染色方法
（1）待厚血膜干燥
（2）甲醇固定薄血膜
（3）待甲醇挥发干净
（4）滴2%的吉氏染液覆盖厚薄血膜，染色30分钟。
（5）取出染好的血片，连同染液在清水中轻轻漂洗一遍，洗去表面吸附的杂质。
（6）放置干燥处晾干。
血膜面朝上，注意不要放反了。
疟原虫血检
血膜的涂制
标准血膜的位置如图所 示
8
血膜编号
血膜制成后，立即用记号笔于玻片面 上写上受检者的号码，以防差错。
9
涂制血膜的注意事项
涂制血膜时，手指只能持载片的边缘，不能 接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白 区以及厚血膜脱落。推片的边缘一定要平滑， 才能使推出的血膜均匀一致。 刚涂制的血膜要平放，干前勿倾斜，以免造 成厚血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而 影响检查结果。 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤， 干透后才能用甲醇固定薄血膜。
6
血膜的涂制
取洁净的玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑 边缘），右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下 角刮取血液4-5ul（约火柴头大小），再用该端中部刮取 血液1-1.5ul（相当于1/4火柴头大小），将左下角的血滴 涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径0.8-1.0cm 的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个白细胞为宜）。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推 片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片和推片之间向 两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25~35度夹角， 从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。推制时速度要均匀， 血滴大小、推片与载片之间夹角大小及展开血膜的速度快 慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平 铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。每张载玻 片上分别做1个薄血膜和1个厚血膜。
28
恶性疟原虫—大滋养体
一般不出现在外周血 虫体小结实，圆形，不 活动 疟色素集中一团，黑褐 色 原虫此时开始集中在内 脏毛细血管
29
恶性疟成熟裂殖体
裂殖子8～36个，通常18～ 24个，排列不规则 疟色素集中成一团 虫体占红细胞体积的2/3至 3/4
疟原虫血涂片镜检技术规范
附件3疟原虫血涂片镜检技术规范一、吉氏液染色--光学显微镜（油镜）检查同时涂制薄血膜和圆形厚血膜，薄血膜须用甲醇固定，用吉氏染色液（Giemsa stain）进行染色。
吉氏染液用pH7.0-7.2的水配成3%的稀释液，可将血片插入染色缸内染色，或用滴管将稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min，若需快速染色，可在2ml水中加吉氏染液3滴，染色6min 。
对临床诊断为脑型疟者，宜用快速染色法，以便能尽快获得确诊依据。
现症患者至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫才判为阴性。
薄血膜可用于原虫形态鉴定。
以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数，或厚血膜中平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。
染色血片中的原虫核呈红色，胞浆呈兰色。
除环状体外，其他各期均可查见褐色的疟色素。
除恶性疟病例外，均可查见各期疟原虫。
一般恶性疟病例，仅查见环状体，或可见配子体。
但脑型疟病例，不仅原虫密度高，查见的环状体比一般的粗大，而且可查见大滋养体和裂殖体，疟色素呈黑褐色，这些特点对明确诊断很有帮助。
还有一点值得注意，在非洲感染的非重症恶性疟病例，其环状体往往比国内一般恶性疟病例所见的环状体粗大，胞浆较多，与间日疟原虫小滋养体相似，容易误判为间日疟原虫，但也不能同时查见大滋养体和裂殖体，这一点有别于间日疟原虫感染。
二、瑞氏液染色-光学显微镜（油镜）检查同时制作厚、薄血膜，用瑞氏染液（Wright stain）进行染色。
在厚血膜上加清水2-3滴溶去血红蛋白，染色效果较好。
染色时，先在薄血膜上直接加约1ml瑞氏液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上共染5-6min。
其他参见吉氏液染色法。
三、荧光素吖啶橙染色-荧光显微镜检查要求涂制成直径为1.2-1.5cm的亚厚血膜，不宜过薄。
须用甲醇固定薄血膜，用清水溶去厚血膜的血红蛋白。
吖啶橙1g加pH6.5-7.0磷酸缓冲液100ml配制成1%吖啶橙母液。
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血疟原虫(MP)厚血片检查法（手工法）标准操作规程1. 实验原理
应用瑞氏染色法对制备好的厚血片进行染色后在显微镜下查找疟原虫。
2. 标本采集
2.1标本采集前病人准备：间日疟及三日疟患者应在发作后数小时至10余小时采血；恶性疟患者，应在发作后20h左右采血。
2.2标本种类：全血或末梢血
2.3标本要求：厚血片的溶血要及时。
3. 标本储存：厚血片的放置期限在夏季不超过48h，冬季不超过62h。
4. 标本运输：室温运输。
5. 标本拒收标准：细菌污染。
6. 操作步骤
6.1 在洁净玻片上，滴患者血液2滴。
6.2 用推片角将血液由内向外转涂成直径约1cm、厚薄均匀的血膜，在室温中自然干燥。
6.3 在干燥的血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟。
脱去血红蛋白的血膜呈浅灰色，倾去溶血液。
6.4 不必待干，进行瑞氏染色。
6.5 干后镜检。
7. 结果判断与分析：在油镜下观察20个视野或以上才能报告“未检出疟原虫”；发现虫体后还应在薄血片上进行分类鉴别。
8. 临床意义：本实验有利于提高疟原虫的阳性检出率。
9. 操作性能：快速简便、阳性检出率高、利于人群普查初筛
10. 方法局限性
10.1 易受溶血不完全的影响。
10.2 经验缺乏者易受其他杂物的影响。
10.3 存在主观判断的失误
10.4 不易鉴别出疟原虫的种类。
11. 参考文献
中国人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程（第二版）.1997,85-86 12. 注意事项
12.1 染色后，水洗时不要先倒去染液，应让清水流进染液，使沉渣冲走。
12.2 注意区别易与疟原虫混淆的其他杂物。
血疟原虫(MP)薄血片检查法（手工法）标准操作规程
1. 实验原理
应用瑞氏染色法对制备好的薄血片进行染色后在显微镜下查找疟原虫，并鉴别其形态种类。
2. 标本采集
2.1 标本采集前病人准备：间日疟及三日疟患者应在发作后数小时至10余小时采血；恶性疟患者，应在发作后20h左右采血。
2.2 标本种类：全血或末梢血
2.3 标本要求：薄血片的血膜厚度要适度均匀以利镜检。
3. 标本储存：室温存贮，尽快检查。
4. 标本运输：室温运输。
5. 标本拒收标准：细菌污染。
6. 操作步骤
6.1 以常法推制成薄片。
6.2 血膜完全干燥后即可进行瑞氏染色。
6.3 在油镜下进行检查。
7. 结果判断与分析
在油镜下观察，进行形态鉴别。
薄血片上3种疟原虫形态特点：
9. 操作性能：快速简便、操作简单。
10. 方法局限性
10.1 阳性检出率较低。
10.2 存在主观判断的失误。
11. 参考文献
中国人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程（第二版）.1997,85-86
12. 注意事项
12.1 染色后，水洗时不要先倒去染液，应让清水流进染液，使沉渣冲走。
12.2注意区别易与疟原虫混淆的其他杂物。
12.3 薄片油镜检查，须找出100或100个以上视野才能报告“未检出疟原虫”。
12.4找到环状体后，须再仔细寻找更为成熟的阶段，以便分类。
如确实未找到更为成熟阶段的疟原虫，可报告为“检出环状体疟原虫”。
12.5 有可能出现2种或3种疟原虫混合感染时，以间日疟与恶性疟原虫混合感染为常见，须注意鉴别。