一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY

BULLETIN

·研究报告·

2009年增刊

收稿日期:2009-04-29

基金项目:西安市科技局科技攻关项目(GG06078)

作者简介:陈洪栋(1986-),女,硕士研究生,研究方向:西北大学生命科学学院细胞生物学方向;E-mail:huijie1022110@ 通讯作者:李红民,E-mail :lihm2006@

引言

质粒DNA 成功转化大肠杆菌(Escherichia coli,

E.coli )由Cohen 等首次报道[1].此后,多位研究者对

影响质粒转化E.coli 的条件如温度、离子强度和种类、质粒分子质量大小等进行了优化和改进[2]

,最

终形成一致认可的转化程序:.

细胞与DNA 在

氯化钙存在下于0~4℃作用一定时间后于42℃短暂热激2~3min,冰浴2~3min ,随后在不含抗生素

的液体培养基中于37℃恢复培养30~60min 后涂

布选择性平板[3]。该方法被称为是E.coli 细胞的标准转化方法,在世界范围内的分子生物学实验室中

广泛应用并不断被完善,最高转化效率可达107~

109克隆/μg 质粒DNA [4]。然而,利用该方法完成质粒DNA 对大肠杆菌的转化,至少需要约2.5h ,对于一般的质粒转化实验而言,比较费时费力。文章作者尝试对这一标准转化程序进行简化,获得一种用质粒DNA 转化大肠杆菌感受态细胞的

实用操作技巧

陈洪栋董文博李红民

（西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室植物生物技术研究室西北大学生命科学学院，西安710069）

摘要:目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA 转化大肠杆菌的操作方法。采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。

以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth 和植物双元表达载体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1。质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后，直接涂布含有筛选抗生素的LB 平板，于37℃培养12~16h 。结果表明，用不同大小的质粒DNA 转化不同的大肠杆菌菌株，都可以获得满足实验要求，转化效率可高达103~4阳性克隆/μg 。该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用。

关键词：Escherichia coli 转化方法质粒

Doohickey for the Standard Transformation Protocol of Plasmids

DNA Transfer into Competent

Chen Hongdong Dong Wenbo

Li Hongmin

(Plant Biotechnology Research Unit,Key Laboratory of Resource Biology Biotechnology in Western China,Ministry of Education School

of Life Science Northwest University,Xi ’an 710069)

Abstract:

The aim of this study was to introduce a doohickey for the transformation of competent

cells with plasmid DNA.

The competent cells of Escherichia coli strains were previously made using the calcium chloride method.The plasmids,pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth and pCAMBIA1301,were employed to transform the different E.coli strains Top10,DH5α,BL21(DE3)and TB1.The mixture of plasmid and competent cell was laid on ice for definite time before being cultured at 37℃degree on selected LB plate with relevant antibiotic for 12~16h.Perfect transformation rate up to 103~4colonies/μg plasmid DNA was obtained.

Key words:Escherichia coli Transformation method Plasmid

生物技术通报Biotechnology Bulletin2009年增刊了比较满意的结果。

1材料与方法

菌株和质粒:两种E.coli菌种类型:用于质粒

扩增与保存的大肠杆菌菌株Top10和DH5α,用于

外源基因表达的BL21(DE3)和TB1,均为本实验

室留存菌种;转化用质粒DNA分别为pUC18(2.69

kb,实验室留存)、pCSN44(4.4kb,美国真菌遗传与保藏中心惠赠)、pAN52-1Not(5.3kb,荷兰TNO营养与食品研究所Punt PJ教授惠赠),pETts(7.8kb,实验室构建留存)、pANth(9.9kb,实验室构建留存), pCAMBIA1301(11.8kb,澳大利亚CAMBIA惠赠).除植物双元表达在载体pCAMBIA1301携带卡那霉素(Kanamycin,Amresco)抗性基因表达盒外,其他质粒均具有氨苄青霉素(Ampicillin,Amresco)抗性基因表达盒。

感受态细胞制备:不同类型细胞的过夜培养液分别以2%的接种量转接至50ml LB培养基中(1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,0.5%NaCl,固体培养基添加1.5%琼脂糖)于37℃振荡培养至A600~ 0.7~0.8,收集菌液并冰浴10min以上,4℃离心收集菌体,重悬于10ml0.1M CaCl2,冰浴10min以上,4℃离心收集菌体,重悬于2ml0.1M CaCl2[4].

质粒DNA制备与转化:所有质粒均按照质粒提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST,Japan)说明书进行。调整质粒浓度至50ng/μL。1μl质粒DNA与100μl感受态细胞混合,冰浴0~60min,吸取10μl 混合液涂布选择性LB平板,37℃培养12~16h观察抗性克隆的形成,统计实验结果。

2结论

文章作者用分子质量介于2.96kb和11.8kb 之间的各种质粒分别转化几种受试大肠杆菌细胞,缺省了标准转化程序中的操作。实验表明,所有质粒均可转化进入相应宿主细胞。结果显示,在缺省热激和恢复培养的转化操作中,质粒DNA与感受态细胞作用的时间称为影响转化效率的重要因素。伴随冰浴时间延长,质粒转化效率明显提高(图1)。当冰浴时间在40min以上时,抗性克隆的数量有的可高达104个/μg DNA.

图1质粒DNA与大肠杆菌感受态细胞作用时间

对转化效率的影响

3讨论

在早期的.遗传转化中,大量的研究致力于提高转化的效率以满足部分实验研究的需要,如基因组文库或cDNA文库的构建,高转化效率对于文库质量至关重要。伴随文库构建方法的发展和改进,质粒已经不再是文库构建当中唯一可选的载体分子。但是,用质粒DNA转化.感受态细胞一直是分子生物学实验室非常重要而且常规化的操作之一,特别是用于质粒载体的扩增与保存、基因克隆、表达载体构建以及质粒DNA在不同宿主细胞间的转移。

作者的研究表明,质粒DNA与大肠杆菌感受态细胞冰浴作用一定时间后直接涂布选择性平板,可以获得足够高的转化效率。尽管转化效率(最高可达104个/μg DNA)较标准转化方法的效率(106-7个/μg DNA)低,甚至低于Pope等建立的“5 min.转化方法”[5],但是利用作者建立的简化程序在较短的时间内获得的转化克隆的绝对数量对于后续操作已经足够。实际上,如果转化的目的只是为了质粒载体的扩增与保存、基因克隆、表达载体构建以及质粒DNA在不同宿主细胞间的转移,热激和恢复培养完全可以省略。使用者可以根据自己的目的和要求,通过调整质粒DNA的浓度及其与感受态细胞冰上作用的时间以获得比较满意的转化效率。另外,因为操作步骤的减少,污染杂菌的风险也随之减少。但是,用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时,热激和随后的恢复性培养操作十分必要,否则大大影响实验结果

。

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