实验五 微生物的接种技术及分离纯
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
微生物实验指导书-教材
微⽣物实验指导书-教材微⽣物学实验指导书⽬录实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)实验⼆培养基的配制 (8)实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)实验四微⽣物的接种技术 (14)试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)实验九乳酸菌的检测 (28)实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。
4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术【基本原理】棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。
因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。
微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。
玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。
玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。
⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。
待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。
此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。
对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。
【实验⽤品】棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。
【⽅法步骤】⼀、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。
制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。
实验五无菌操作及接种技术专家讲座
L、接种后斜面培养基，放在恒温箱内培养。
实验五无菌操作及接种技术专家讲座
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斜面接种示意图
实验五无菌操作及接种技术专家讲座
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2）、平板接种技术
A、加热融化培养基
将三角瓶瓶口包扎绳解开，轻轻旋动棉塞，然后将瓶子 放入微波炉中加热，选取高火力，加热1min后取出晃动， 重复加热直至培养基完全溶解。
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实验五无菌操作及接种技术专家讲座
图4 接种环灭菌
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以下操作，需要使管口靠近火旁
F、用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞；
G、以火焰灼烧管口，灼烧时应不停转动试管口， 使试管口沾染少许菌得以烧死；
H、将烧过接种环伸入菌种试管内，先将环接触没 有长菌培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种菌 体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环 抽出试管（图5），注意尽可能不要使环部分碰钉 子到管壁，取出后不可使环经过火焰；
原理：超净工作台洁净环境是在特定空间内，洁净空 气(进滤空气)按设定方向流动而形成。以气流方向来分， 现有超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。
实验五无菌操作及接种技术专家讲座
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垂直流超净工作台
垂直流超净工作台
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水平流超净工作台
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超净台使用与维护
风速保持在0.32-0.48米/秒 使用前打开紫外灯照射40~60min 开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%酒精或0.5%过氧
实验五无菌操作及接种技术专家讲座
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(优选)实验五培养基的使用特点和微生物接种方法
2. 富集培养
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生 理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特 定微生物的需要。
常用的选择培养基
S.S琼脂（沙门氏菌、志贺氏菌分离用培养基）
组成成分：乳糖、胆盐、柠檬酸铁、柠檬酸纳、煌绿、 中性红、硫代硫酸钠等，强选择性抑制大肠杆菌，分 离沙门菌 煌绿、胆盐、柠檬酸纳抑制非肠道菌 大肠杆菌分解乳糖而产酸，使胆盐析出，菌落中 心浑浊呈深红色，柠檬酸铁可使产生硫化氢的菌 落呈黑色 硫代硫酸钠缓和胆盐对沙门氏菌的有害作用，中 和煌绿、中性红的毒性，使大肠杆菌的红色菌落 更加鲜艳
三糖铁琼脂或克氏双糖铁
三糖铁琼脂含有乳糖、蔗糖、和葡萄糖，蔗糖：区别普
通变形杆菌（＋）、沙门氏菌（-）
克氏双糖铁成分 蛋白胨； 牛肉膏 ； 酵母膏 ；乳糖 ；
葡萄糖； 氯化钠 ； 柠檬酸铁铵 ；硫代硫酸钠 ； 琼脂 ； 酚红为指示剂，黄色为产酸，红色为产碱
观察克氏双糖接种后斜面、底层产酸、产气、产H2S的情 况，通常大肠杆菌斜面不产酸、底层产酸产气、不产H2S
今天的实验
菌种：大肠杆菌、沙门菌、青霉 采用无菌操作进行移植 学会分区划线 所有平皿和试管必须有标记 18－24小时（真菌下周观察）观察试验结
果，描述固体培养和液体培养的细菌培养 特征
步骤
两个人为一组，一个接种大肠杆菌，一个 接种沙门菌
LB液体移植 普通琼脂：分区划线 麦康凯：分区划线 半固体：穿刺 克氏双糖：先穿刺后接种斜面
三、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；
待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
实验五土壤中细菌纯种分离和培养
（二）培养
将前面制作的平板倒置于培养箱， 30℃培养24～48h，然后观察结果。
（三）挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌 落接种斜面，如果不纯，需进一步挑取此 菌落采取稀释平板法或划线分离法分离， 直至获得纯培养。
分离平板
五、注意事项
制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀 分散在稀释液中。
♫将培养皿平放在桌上， 顺时针和反时针来回转 动培养皿，使培养基和 菌液充分混匀，冷凝后 即成平板（每组制培养 皿3套）。
③对 照 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待
凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。
2、平板划线分离法
（1）平板的制作
将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平 板。
1、稀释平板分离法
（1）取样 选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm 深度的或特殊要求的地方土壤，装入灭过菌 的袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实 验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液
◆ 将1瓶90mL和7管9mL的无菌水排列好，按 10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。
（2）划线
用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养 皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指 和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手 拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环 伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（每组 做三皿）。
注意：切勿划破培养基
划线的方式可取图中任何一种
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
注意：在土壤稀释过程中，吸取不 同梯度的菌液需换用不同的吸管。
（3）平板的制作 ①吸取菌液：பைடு நூலகம்
用无菌移液管吸取菌 液于无菌培养皿内。
微生物的分离和纯化实验原理及步骤
实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。
单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
微生物常用的接种方法
微生物常用的接种方法微生物的接种是微生物学实验中的一个重要步骤，它是将微生物从一个培养基转移到另一个培养基的过程。
接种方法的选择对于微生物的培养和研究具有重要意义。
下面将介绍一些微生物常用的接种方法。
一、平板接种法。
平板接种法是将微生物接种在培养基的表面上，通过接种棒或铅笔头的方式在培养基表面画线或涂抹，形成菌落。
这种接种方法适用于培养革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，通常用于分离和计数微生物。
在进行平板接种时，需要注意接种的均匀性和细菌数量的控制，以避免产生过多或过少的菌落。
二、液体接种法。
液体接种法是将微生物接种在含有营养物质的液体培养基中，通过摇床或振荡器进行培养。
这种接种方法适用于培养需要大量微生物的情况，如大规模生产微生物菌种或进行微生物代谢产物的生产。
在进行液体接种时，需要注意培养液的搅拌速度和通气情况，以保证微生物的充分生长和代谢。
三、斜面接种法。
斜面接种法是将微生物接种在倾斜的培养基表面上，通过接种棒或铅笔头的方式在斜面上画线或涂抹，形成菌落。
这种接种方法适用于培养对氧需求较高的微生物，如厌氧菌和微需氧菌。
在进行斜面接种时，需要注意斜面的倾斜角度和接种的均匀性，以保证微生物的充分生长和代谢。
四、深层接种法。
深层接种法是将微生物接种在含有固体琼脂的试管或培养瓶中，通过接种棒或铅笔头的方式在琼脂表面插入或涂抹，形成菌落。
这种接种方法适用于培养对氧需求较低的微生物，如厌氧菌和微需氧菌。
在进行深层接种时，需要注意琼脂的固化温度和接种的深度，以保证微生物的充分生长和代谢。
五、滴播接种法。
滴播接种法是将微生物接种在含有营养物质的琼脂平板上，通过滴管或移液器滴播微生物悬液，形成菌落。
这种接种方法适用于培养对氧需求较高的微生物，如厌氧菌和微需氧菌。
在进行滴播接种时，需要注意滴播的均匀性和微生物悬液的浓度，以保证微生物的充分生长和代谢。
总结，微生物的接种方法多种多样，选择合适的接种方法对于微生物的培养和研究具有重要意义。
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实验程序2
（微生物的分离—平涂抹法）
实验程序2（微生物的分离—混菌法）
制平板 吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5 、 10－6土壤稀释液0.1mL，加在空培养皿中。 混菌 水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混 匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒 温培养箱培养。 计算出每克土壤中放线菌的数量。 挑取单个菌落，进行划线分离。
实验程序4
（微生物的接种方法）
接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、 试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接 种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图－6）。
图－6
思考题
平板培养时为什么要把培养皿倒置？ 在划线分离时，为什么每次都需要将接种环 上的剩余物烧掉？
实验步骤
稀释涂板法 划线分离 微生物的培养
制平板： 每组制培养 皿3付。
在无菌培养 皿底部注明 分离菌名、 稀释度、组 别、班级。
实验步骤1（微生物的分离—稀释涂平板法）
制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡 10min，即为稀释10－1的土壤悬液。
实 验 五
结 束
实 验 五
微生物的接种技术及分离纯化
目的要求
初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏 的基本方法。 练习微生物接种、移植和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
实验原理
土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种 微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营 养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它 适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰 其他一些不需要的微生物，再用各种方法分 离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
实验程序3（微生物的分离—平板划线法）
制成平板。 凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－1）在平板上划 线。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面 作连续划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环， 先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养 皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第 一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四 次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯 化，最后得到纯培养。
在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管
图－1 土壤稀释液的 制备和稀释液的取样
吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、 10－5、 10－6土壤稀释液0.1mL，加在已制 好的平板培养基上。 涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀 铺平，倒置于恒温箱培养。 计算出每克土壤中细菌的数量。 即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培 养皿接种液的稀释倍数即得。 挑取单个菌落，进行划线分离。
稀释涂板法、划线分离
实验材料
样品：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、 装有9mL无菌水的试管。 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。 试剂：1万U/mL链霉素液、10％苯酚
2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、 10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀释成10－1的土壤液， 振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入 10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之 充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至 10－4、10－5 、10－6土壤稀释液。