胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析_俞思明

第３　２卷，第８期 光谱学与光谱分析Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．８，ｐｐ２１６６－２１７０２　０　１　２年８月 Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｔｒａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ａｕｇｕｓｔ，２０１２　胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析俞思明１，彭运平１，２＊，于淑娟１，吕　欢１，郭　丞１１．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州　５１０６４０２．广州万孚生物技术有限公司，广东广州　５１０６４０摘　要　利用共价偶联的方法制备了胶乳－抗体蛋白复合物，并采用荧光光谱法对复合物的性质进行了研究，以揭示胶乳微球与抗体蛋白之间的相互作用机理。

内源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后，抗体蛋白的最大发射峰发生显著蓝移，最大发射峰强度显著降低，抗体蛋白的三级结构发生了一定的变化，胶乳微球与抗体蛋白之间的相互作用对抗体蛋白的内源荧光有显著的猝灭作用，猝灭效果随着偶联体系ｐＨ值以及胶乳浓度的增加而增强，猝灭机制为静态猝灭。

外源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后抗体蛋白的最大发射峰强度显著增强，且随着偶联体系ｐＨ值的升高，抗体蛋白的疏水性显著降低，随着胶乳浓度的增加，疏水性逐渐升高。

关键词　胶乳－抗体蛋白复合物；抗体蛋白；荧光光谱中图分类号：Ｑ７１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－０５９３（２０１２）０８－２１６６－０５　收稿日期：２０１２－０２－２３，修订日期：２０１２－０６－１０　基金项目：国家科技部（８６３计划）项目（２０１０ＡＡ０２２８０２）和国家自然科学基金项目（３１０７１５６４）资助　作者简介：俞思明，１９８５年生，华南理工大学轻工与食品学院硕士研究生 ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｙｉｙａ＠１２６．ｃｏｍ＊通讯联系人 ｅ－ｍａｉｌ：ｐｙｐ＠ｗｏｎｄｆｏ．ｃｏｍ．ｃｎ引　言 近年来，包被有抗体／抗原的胶乳微球已被广泛应用于免疫诊断中［１，２］。

免疫诊断的理论基础是抗原与抗体间的特异性反应［３］，当抗原／抗体连接在胶乳微球表面时，一旦抗原／抗体与胶乳微球上的抗体／抗原发生特异性结合，由于胶乳的凝聚作用，免疫反应从宏观上被放大了。

所以将不同的抗原／抗体连接在胶乳微球表面，通过免疫检测，可将一些常见疾病，如肝炎、流感等快速检测出来。

常用的制备胶乳－抗体蛋白复合物的方法有两种：物理吸附法和共价偶联法。

由于吸附会引起固定于胶乳微球表面蛋白的部分解吸及结构的变化，所以用物理吸附法制备的胶乳－抗体蛋白复合物特异性低，在生物诊断中的应用受到限制［４－６］。

共价偶联法能在最大限度上控制吸附法中出现的问题，成为目前制备胶乳－抗体蛋白复合物的主要方法。

在胶乳－抗体蛋白复合物的制备过程中，蛋白与胶乳微球的相互作用总会存在，而这些相互作用会对固定于胶乳微球表面抗体蛋白的功能特性、空间结构、生物活性及其在生物诊断中的应用产生一定的影响，所以研究它们之间相互作用的机理以及这些相互作用对胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白性质的影响显得意义重大。

近年来，常用于研究微球与蛋白质之间相互作用的方法主要有：荧光光谱法、紫外－可见光谱法（ＵＶ－Ｖｉｓ）、圆二色谱法（ＣＤ）、傅里叶变换红外光谱法（ＦＴＩＲ）及核磁共振法（ＮＭＲ）［７－１０］。

然而，在这些方法中，荧光光谱法被认为是一种最简单、最有效的研究微球与蛋白质间相互作用的方法［１１，１２］。

利用共价偶联法制备了胶乳－抗体蛋白复合物，并且采用荧光光谱法研究了胶乳微球与抗体蛋白间的相互作用以及相互作用对抗体蛋白结构性质的影响，以期为胶乳－抗体蛋白复合物在生物诊断中的应用提供理论基础。

１　实验部分１．１　材料与试剂胶乳微球（粒径２２０ｎｍ），德国莫克公司；ＨＣＧ－α单克隆抗体，美国Ｓｉｇｍａ公司；１－乙基碳酰二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ），Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ），均为美国赛默飞世尔科技公司；１－苯胺基萘－８－硝基苯甲酸盐（ＡＮＳ），美国Ｓｉｇｍａ公司；其余化学试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

１．２　主要仪器超声波细胞粉碎机（ＪＹ－９２ＩＩ型），宁波新芝生物科技股份公司；荧光光谱仪（Ｆ－４５００），日本Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｋｏｋｉ公司。

１．３　胶乳－抗体蛋白复合物的制备取０．１ｍＬ红色胶乳微球，加入０．９ｍＬ，０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ　６．０的乙磺酸缓冲液（ＭＥＳ）均匀混合后加入ＥＤＣ和Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ各５ｍｇ活化，室温下温和搅拌１５ｍｉｎ，１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸缓冲液（ＰＢＳ）重复清洗沉淀三遍，去上清，沉淀经０．１ｍｏｌ·Ｌ－１　ＰＢＳ重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球。

取４０μＬ　ＨＣＧ抗体（１０ｍｇ·ｍＬ－１）加入到１ｍＬ经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌４ｈ，１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，沉淀用含０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０的ＰＢＳ（０．１ｍｏｌ·Ｌ－１）重复清洗三遍，然后用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸缓冲液（ＰＢＳ）复溶，即得到胶乳－抗体蛋白复合物溶液。

１．４　内源荧光光谱分析荧光光谱的测定参照文献［１３］完成。

在激发波长为２９５ｎｍ（狭缝５ｎｍ）进行发射波长扫描（３２０～４００ｎｍ），每次测量前，扣除空白缓冲液背景并校正。

用０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１　ＰＢＳ将抗体胶乳微球浓度调整为２×１０－５～１．０×１０－４　ｍｏｌ·Ｌ－１，体系的ｐＨ值为３．０～９．０。

１．５　外源荧光光谱分析将１０μＬ　ＡＮＳ加入到２ｍＬ样品溶液中，振荡，避光静置１５ｍｉｎ，然后在激发波长λｅｘ＝３９０ｎｍ，发射波长λｅｍ＝４７０ｎｍ条件下测定样品的荧光强度，发射波长的范围为４００～６００ｎｍ。

每次测量前，用空白缓冲液扣除背景并校正。

１．６　表面疏水指数（Ｓ０）的测定利用ＡＮＳ作为荧光探针测定胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白的表面疏水指数（Ｓ０），在ｐＨ　３．０～９．０，胶乳浓度２×１０－５～１．０×１０－４　ｍｏｌ·Ｌ－１的条件下测定了胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白的表面疏水指数的变化情况。

每个样品用０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢ（ｐＨ　７．０）缓冲液进行稀释，使得抗体蛋白的浓度范围在０．０１～０．４ｍｇ·ｍＬ－１。

每个蛋白浓度下的荧光强度差减未添加ＡＮＳ空白样品的荧光强度得到蛋白的相对荧光强度。

以荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数Ｓ０。

１．７　统计分析所有实验均重复３次，每次实验计算出平均值和标准差。

利用ＳＰＳＳ软件对所有实验结果进行方差分析以确定差异显著性（ｐ＜０．０５）。

２　结果与讨论２．１　胶乳－抗体蛋白复合物的内源荧光光谱分析荧光光谱能够提供蛋白质分子中荧光生色基团所处的微环境信息，进而得到蛋白质结构变化等有用信息［１４］。

有研究表明，微粒与蛋白质分子中荧光基团之间的相互作用将会引起峰强度，峰位移等荧光参数的变化，通过分析这些荧光参数的变化能获得荧光基团所处的微环境及其与微球间相互作用的规律等信息［１５，１６］。

色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸为蛋白质的三种内荧光基团，赋予了蛋白质的荧光特性，其中色氨酸被认为是对环境变化最为敏感的氨基酸［１７］，所以本研究通过测定胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白上色氨酸的荧光发射光谱，探索抗体蛋白结构性质的变化以及抗体蛋白与胶乳微球间的相互作用。

图１给出了不同的ｐＨ值条件下，胶乳－抗体蛋白复合物的内源荧光光谱图。

由图１可以发现，抗体蛋白的最大发射峰显著蓝移（约１５ｎｍ）；同时，抗体蛋白的最大发射峰强度也显著降低，且随着ｐＨ值的升高而逐渐降低。

图２给出了不同胶乳微球浓度条件下，胶乳－抗体蛋白复合物的内源荧光光谱图，与图１的趋势类似，抗体蛋白的最大发射峰显著蓝移，且抗体蛋白的最大发射峰强度也显著降低，随着胶乳微球浓度的升高而逐渐降低。

研究结果表明［１８，１９］，最大发射峰位移的变化可以提供荧光基团所处微环境附近极性变化的重要信息，蓝移说明蛋白质的三级结构发生了一定的变化，其色氨酸残基处于一个更为疏水的微环境中；而红移意味着色氨酸残基更加暴露于周围溶剂中。

抗体蛋白的最大发射峰显著蓝移，说明抗体蛋白的三级结构发生了一定变化，其分子上的氨基酸残基处于一种更为疏水的环境中，Ｍｏｎｉｃａ［２０］报道了类似的研究结果。

除了显著的蓝移，荧光猝灭作用也非常明显。

有研究表明［２０，２１］纳米微球与蛋白间的相互作用对蛋白质的内源荧光有显著的猝灭作用，猝灭效果与纳米微球的大小和浓度有关。

因此可以通过研究荧光猝灭作用来揭示纳米微球与蛋白质间的相互作用。

荧光猝灭效果可以用Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ方程式来描述Ｆ０Ｆ＝１＋Ｋｑτ０［Ｑ］＝ＫＳＶ［Ｑ］（１） 这里的Ｆ０和Ｆ分别是有、无猝灭剂时的荧光强度，Ｋｑ为生物分子的猝灭常数，τ０为无猝灭剂时荧光团的寿命值，ＫＳＶ为Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ荧光猝灭常数，Ｑ为猝灭剂浓度。

表１的给出了不同胶乳浓度下测定的ＫＳＶ值。

由表１可以发现，随着胶乳浓度的增大，ＫＳＶ值逐渐增大，表明猝灭效果随着胶乳浓度的增大增强。

对于生物大分子，τ０值大约为５×１０９　ｓ，根据式（１），计算出生物大分子的荧光猝灭常数Ｋｑ值的范围为１０１２～１０１３　Ｍ－１·Ｓ－１，远远大于由动态碰撞机制得到的τ０值（２．０×１０１０　Ｍ－１·Ｓ－１）。

实验中的荧光猝灭并非由动态碰撞所引起，而是形成了基态荧光基团复合物（胶乳－抗体蛋白复合物）而产生的静态猝灭。

Ｆｉｇ．１　Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ｎａｔｉｖｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐＨ　ｖａｌｕｅｓ．（ａ：ｎａｔｉｖｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｂ～ｆ：ｐＨ　ｆｒｏｍ　３．０ｔｏ　９．０）７６１２第８期 光谱学与光谱分析Ｆｉｇ．２　Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ｎａｔｉｖｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌａｔｅｘ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．（ａ：ｎａｔｉｖｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏ－ｔｅｉｎ；ｂ～ｆ：ｆｒｏｍ　２×１０－５　ｔｏ　１．０×１０－４　ｍｏｌ·Ｌ－１）Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ＫＳＶｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｌａｔｅｘ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓＬａｔｅｘ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｏｌ·Ｌ－１）ＫＳＶ／（ｍｏｌ·Ｌ－１）２×１０－５　４．１４×１０５±０．１２×１０５４×１０－５　５．４０×１０５±０．０５×１０５６×１０－５　８．３３×１０５±０．０１×１０５８×１０－５　８．７１×１０５±０．２５×１０５１×１０－４　８．８３×１０５±０．１７×１０５２．２　胶乳－抗体蛋白复合物的外源荧光光谱分析ＡＮＳ是一种阴离子疏水探针，对其所处微环境的极性非常敏感，能够与蛋白分子中的疏水基团结合而使蛋白的荧光强度增强［２１］。