Western_Blot详解及问题分析.ppt43页PPT
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Westernblot实验技术PPT
待测蛋白状态 凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
ReducedDenatured
ReducedNative
OxidizedDenatured
OxidizedNative
还原，变 性
还原，不 变性
不还原， 变性
不还原， 不变性
含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS
含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
分子筛效应
AP-TEMED系统 单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸铵（AP） 诱发剂：四甲基乙二胺（TEMED）
配胶温度：室温或37℃ 配胶试剂：
AP：现用现配或分装冻存 TEMED ：最后加,边加边晃 Tris-HCl: 上下胶pH勿混(上6.8/下8.8) 丙烯酰胺: 神经毒性
蛋白分子量 （ku） 4-40 10-43 12-60 20-80
25-200 57-212
凝胶浓度 （％） 20 15 12 10 8 5
检测；
WB常见问题
无信号(白板)或 弱信号(不是白板胜似白板) 高背景(黑板、几尽黑板) 非特异性条带（杂带） 脏带（操作）、补丁染色 表情条带（微笑、皱眉） 闹鬼（鬼带、鬼影） 拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带 其它
无信号/弱信号问题(白板)
1. 样品
样品中无目的蛋白或目的蛋白降解---- ①设立阳性对照②检查封闭液 是否有蛋白酶③使用蛋白酶抑制剂
封闭问题
定义:
使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂 的缓冲液（PBST/TBST）封闭杂交膜 上的非特异性位点
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
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上样缓冲液 Loading buffer
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第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
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3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
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3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
《westernblot讲解》PPT课件
K和ɑ为常熟，de为蛋白质移动距离，do为小 分子示踪物的移动距离。
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精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
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精选课件ppt 25
19
精选课件ppt 20
图像分析
精选课件ppt
将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
21
注释
精选课件ppt
SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
8
精选课件ppt
仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
9
样品制备
精选课件ppt
样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
7
试剂及仪器准备
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TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
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图像分析
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将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
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注释
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SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
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仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
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样品制备
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样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
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试剂及仪器准备
蛋白质印迹法westernblot应用介绍幻灯片PPT
(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋
凝胶浓度（％） 6 8 10 12 15
最佳分离范围（KD) 50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶〔别离胶〕
静置1h后制上层胶〔浓缩胶〕 2、配制上层胶〔浓缩胶〕
加完后插上梳子，静置1h
制胶
制胶过程本卷须知：
➢操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 ➢加完别离胶后胶，加水液封时要很慢，否那么胶会 被冲变型。 ➢灌胶时开场可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡。 ➢别离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
Western Blot流 程
收集蛋白样品
(Protein sample preparation)
〔1〕贴壁细胞蛋白样品收集
分屡次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 参加PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心
收集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心
Western Blot 介 绍
蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克〔George Stark〕。在尼尔·伯奈特〔Neal Burnette〕于 1981年所著的?分析生物化学?〔Analytical Biochemistry〕中首 次被称为Western Blot。
Western_Blot详解及问题分析43页PPT
Western Blot
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？
转膜缓冲液过热？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
电转仪长期使用导致海绵变薄，“三 明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压
Western Blot
插入梳子
Staking gel Separating gel
Western Blot
Western Blot
转膜
要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法(HRP)
Western Blot
Western Blot
膜解吸方法（膜的重复利用）
通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离， 适用于任何化学发光底物系统。
酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位 点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任 何化学发光底物系统。
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取， 包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
Western Blot
蛋白样品的定量
目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
western blot原理及操作方法ppt课件
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
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一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST