凝胶渗透柱层析法
凝胶柱层析
凝胶柱层析凝胶柱层析是一种广泛应用于生物化学和分子生物学领域的分离和纯化技术。
它利用凝胶柱的孔隙大小和化学特性，将混合物中的分子按照大小、形状、电荷等性质分离开来。
本文将详细介绍凝胶柱层析的原理、步骤、优缺点及应用。
一、凝胶柱层析的原理凝胶柱层析的原理基于分子在凝胶孔隙中的分布，分子越小，越易进入凝胶孔隙，因此通过凝胶柱时，分子会按照大小被逐渐分离开来。
此外，凝胶柱的孔隙大小和化学特性也会影响分子的分离效果。
例如，聚丙烯酰胺凝胶柱适用于分离蛋白质和核酸，而琼脂糖凝胶柱适用于分离多糖和蛋白质。
二、凝胶柱层析的步骤凝胶柱层析的步骤包括制备凝胶柱、样品加载、洗脱和收集。
1. 制备凝胶柱：根据需要选择合适的凝胶材料和孔隙大小，制备凝胶柱。
制备过程中需要注意凝胶柱的均匀性和孔隙大小的一致性。
2. 样品加载：将待分离的混合物样品加载到凝胶柱上方，并缓慢滴加缓冲液，使样品逐渐进入凝胶孔隙中。
3. 洗脱：根据需要，选择合适的缓冲液和洗脱液，将未结合的分子洗脱出来。
4. 收集：根据需要，收集洗脱液中的目标分子。
三、凝胶柱层析的优缺点凝胶柱层析具有以下优点：1. 分离效果好：凝胶柱层析能够将混合物中的分子按照大小、形状、电荷等性质分离开来，分离效果好。
2. 操作简便：凝胶柱层析的操作简便，不需要复杂的设备和技术。
3. 适用范围广：凝胶柱层析适用于分离和纯化各种生物大分子，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶柱层析的缺点主要包括：1. 分离速度慢：凝胶柱层析的分离速度较慢，需要较长的分离时间。
2. 需要大量样品：凝胶柱层析需要大量的样品，才能够获得足够的目标分子。
四、凝胶柱层析的应用凝胶柱层析在生物化学和分子生物学领域有着广泛的应用。
1. 蛋白质纯化：凝胶柱层析是蛋白质纯化的重要手段之一，可以将混合物中的蛋白质分离开来。
2. 核酸纯化：凝胶柱层析也可以用于核酸的纯化和分离，如将DNA和RNA分离开来。
3. 多糖分离：凝胶柱层析还可以用于多糖的纯化和分离，如将不同种类的多糖分离开来。
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点(一) 基本原理凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。
较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。
这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。
洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。
不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。
时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。
+ Vi 时出现洗脱峰。
(二)凝胶的类型及性质1.交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。
交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。
交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。
各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。
在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。
在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120?消毒10分钟而不改变其性质。
如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
凝胶柱层析操作方法
凝胶柱层析操作方法凝胶柱层析是一种常见的生物化学分离和纯化技术，主要用于分离和纯化蛋白质、核酸、多糖以及其他生物大分子。
它是基于溶液中分子在凝胶柱中通过扩散和吸附/排斥作用的差异，从而实现分离和纯化的过程。
凝胶柱层析的操作步骤如下：1. 准备工作首先，准备好所需的实验设备和试剂，包括凝胶柱、载体溶液、平衡缓冲液、洗脱缓冲液以及待纯化的样品等。
2. 凝胶柱的平衡将凝胶柱放入层析缸中，并用足够的平衡缓冲液预先洗涤凝胶柱，以确保凝胶柱内缸体达到平衡状态。
洗涤凝胶柱的缓冲液通常是与样品一样的成分，以确保样品在平衡和层析过程中的稳定性。
3. 样品的加载将待纯化的样品加入凝胶柱顶部，让样品自由通过凝胶柱，在凝胶柱中发生分子的扩散和吸附/排斥作用，不同组分因差异而逐渐分离。
4. 缓冲液的加入与洗脱根据需要，逐渐加入一定体积的洗脱缓冲液，通过调整洗脱缓冲液的组成和浓度，使目标分子从凝胶柱上洗脱下来。
洗脱过程中，可以利用不同组分在凝胶柱中的吸附/排斥特性来实现分离纯化。
凝胶柱层析的洗脱缓冲液通常是在平衡缓冲液的基础上，通过调整pH值、离子浓度、缓冲剂浓度等参数来实现。
常用的洗脱缓冲液包括梯度洗脱和逐步洗脱等方法。
5. 收集分离纯化的样品通过洗脱，将目标物质从凝胶柱上洗脱下来，可以收集到分离纯化后的样品。
收集的样品可以进行后续的实验分析、储存或进一步纯化。
凝胶柱层析操作中需要注意的事项：1. 凝胶柱的选择根据待纯化样品的性质和分子大小，选择合适的凝胶柱类型和尺寸。
常见的凝胶柱类型包括聚丙烯酰胺凝胶、超大孔凝胶、琼脂糖凝胶等。
2. 缓冲液的选择根据待纯化样品的特性，选择适当的缓冲液，确保样品在平衡、层析和洗脱过程中的稳定性。
常用的缓冲液有Tris-HCl、PBS等。
3. 流速的控制凝胶柱层析过程中，要控制好流速，以避免分子在凝胶柱中过快通过，影响分离效果。
流速的选择应根据试剂和样品的性质进行调节。
4. 洗脱缓冲液的选择需要根据目标分子的特性选择合适的洗脱缓冲液，确保洗脱效果和分离纯化效果的最大化。
凝胶渗透色谱法的原理
凝胶渗透色谱法的原理
凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC），也称为分子筛色谱法，是一种基于溶液中分子大小分离的技术。
该技术被广泛应用于生化、制药、
食品、环境等领域中，用于分离、纯化、鉴定高分子化合物。
凝胶渗透色谱法的原理是利用一系列具有不同孔径大小的凝胶颗粒（Gel）填
充在柱中，样品在柱内由于凝胶颗粒的孔径大小不同而被分离。
样品分子大小与孔径大小相似的凝胶颗粒被卡在凝胶层内部，而分子大小较小的样品则能够进入凝
胶颗粒内部，从而在凝胶层内通过相互作用分离出来。
分子大小大的化合物被挡住，难以进入凝胶颗粒，所以在柱头出现较早的峰；分子大小小的化合物可以进入凝胶颗粒内部，所以在柱头出现较晚的峰。
凝胶渗透色谱法通常使用列柱层析法进行，样品在柱内通过输送溶液、柱内平衡等步骤，实现分离纯化。
在进行凝胶渗透色谱分析时，需要根据样品分子大小的不同选择合适的凝胶颗粒，以获得最佳的分离效果。
同时，在样品分析时还需要注意样品的稳定性、浓度等因素，以避免对分析结果的干扰。
凝胶渗透色谱法具有分离效率高、重复性好、分析速度快等优点，广泛应用于高分子材料的研究与生产领域。
凝胶柱层析原理
凝胶柱层析原理凝胶柱层析是一种常用的生物分离技术，它利用凝胶柱对生物大分子进行分离和纯化。
凝胶柱层析原理主要是利用生物大分子在凝胶柱中受到孔隙大小和电荷的影响，从而实现分离的目的。
在凝胶柱层析中，样品通过柱子时，不同大小和电荷的生物大分子会在柱子中以不同的速率迁移，从而实现分离。
首先，凝胶柱层析原理的关键在于凝胶柱的孔隙大小。
凝胶柱通常是由聚丙烯酰胺或琼脂糖等材料制成，其孔隙大小可以根据需要进行调整。
当样品通过凝胶柱时，较大的生物大分子无法进入凝胶柱的内部孔隙，因此会以较快的速率通过柱子，而较小的分子则可以进入更深的孔隙中，因此会以较慢的速率通过柱子。
通过这种方式，不同大小的生物大分子可以在凝胶柱中实现分离。
其次，凝胶柱层析原理也与生物大分子的电荷有关。
生物大分子通常带有正电荷、负电荷或无电荷，而凝胶柱则可以根据生物大分子的电荷特性进行选择。
当样品通过带有电荷的凝胶柱时，带有相同电荷的生物大分子会受到柱子的排斥，因此会以较快的速率通过柱子，而带有相反电荷的生物大分子则会被吸附在柱子中，因此会以较慢的速率通过柱子。
通过这种方式，不同电荷特性的生物大分子可以在凝胶柱中实现分离。
最后，凝胶柱层析原理还可以根据生物大分子的亲疏水性进行分离。
某些凝胶柱具有亲水性，而某些凝胶柱具有疏水性，因此可以根据生物大分子的亲疏水性特点选择合适的凝胶柱进行分离。
通过这种方式，可以实现对亲疏水性不同的生物大分子进行有效分离。
综上所述，凝胶柱层析原理是利用凝胶柱对生物大分子进行分离和纯化的一种重要技术。
通过控制凝胶柱的孔隙大小、电荷特性和亲疏水性，可以实现对不同大小、电荷和亲疏水性的生物大分子进行高效分离。
因此，凝胶柱层析原理在生物化学、生物医学等领域具有广泛的应用前景，对于研究生物大分子的结构和功能具有重要意义。
凝胶柱层析原理
凝胶柱层析原理
凝胶柱层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法。
它基于生物大分子在凝胶柱中的不同迁移速率来实现分离。
凝胶柱通常由聚丙烯酰胺或琼脂糖等凝胶材料制成，其中具有不同孔隙大小的凝胶颗粒被填充在柱中。
凝胶柱的直径和长度依据需要进行选择。
凝胶柱层析的原理是根据生物大分子的大小、形状和电荷来进行分离。
当混合样品加入凝胶柱时，大分子会在凝胶颗粒的孔隙中通过扩散、分子筛效应或凝胶颗粒与生物大分子之间的作用力来进行分离。
较大的分子通过凝胶柱时移动较慢，而较小的分子则移动较快。
在凝胶柱层析过程中，流经柱的缓冲液起着溶解和平衡作用。
缓冲液中的离子浓度和pH值通常会影响生物大分子与凝胶颗粒之间的作用力，进而影响分离效果。
因此，选择合适的缓冲液条件是确保分离过程顺利进行的关键。
凝胶柱层析具有一些显著优点。
首先，它可以在常温下进行，避免生物大分子在高温下的变性和不可逆失活。
其次，由于凝胶材料的多样性，凝胶柱层析可以选择合适的分离材料来适应不同的分子分离需求。
此外，凝胶柱层析可以高效地分离生物大分子并获得纯度较高的产物。
总之，凝胶柱层析通过利用凝胶柱中不同孔隙大小的凝胶颗粒来实现生物大分子的分离和纯化。
它是一种常用且有效的生物分离技术。
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
凝胶柱层析
凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
基本原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
优点它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
使用方法⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
凝胶渗透柱层析法
南大生科院基础实验中心庄苏新、罗喜牛
4、试剂与配制：
4-1、试剂：
(1)、葡聚糖凝胶
(2)、磷酸氢二钠
(3)、磷酸二氢钠
(4)、血红蛋白
(5)、核黄素
4-2、试剂配制：
(1)、磷酸缓冲液（0.05 mol / L,pH 7.4）的配制：
分别称取磷酸二氢钠克；磷酸氢二钠克于一烧杯中，加蒸馏水毫升，搅拌溶解即可。
(2)、样品溶液的配制：
分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升，
搅拌溶解即可(2.0mg/ml)。
5、操作步骤：
（1）、选择固定层析柱：
观察层析柱底端过滤及其它部件连接是否完好？将选择的层析柱垂直固定到台式铁架上，关闭柱底端出口，并向柱内注入一定量的平衡缓冲液，然后再打开柱底端出口，排除柱低端和连接出口的塑料管道内气泡，气泡排除完毕，再次关闭柱底端出口，并在层析柱内留有适量的平衡缓冲液。
（2）、装柱方法：
将烧杯中处理好的葡聚糖凝胶，用玻棒充分搅拌成悬浮液，随即用玻棒引流缓缓倒入层析柱中，静置约5分钟（或出现明显分层现象），再打开层析柱底端出口，让其柱内液体流出，同时柱内葡聚糖凝胶此时也向柱底端下沉，当柱床体积表面不下沉时，此时的高度即为柱床体积的实际高度，观其柱床体积高度是否与实验要求相一致。
如果柱床体积过高或过低，则需要弃去多余或添加适量的葡聚糖凝胶，但是，无论是弃去多余葡聚糖凝胶还是添加适量的葡聚糖凝胶，首先需要关闭层析柱底端出口。
然后用玻棒将柱床体积上部（要有足够的磷酸缓冲液，便于搅匀）1/3处充分搅匀，搅匀后用滴管吸去多余的葡聚糖凝胶或继续添加适量的葡聚糖凝胶悬浮液，如此反复多次操作，直至沉积高度达到实验所需的柱床体积高度为止。
同时在装柱过程中要防止柱床流干。
柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整等。
（3）、平衡方法：
柱装好后，使柱床体稳定5.0—10.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用
2.0倍于床体积的磷酸缓冲液进行充分的平衡。
同时也使层析柱床体稳定。
平衡完毕，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内平衡缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备加样。
（4）、加样方法：
加样前先启动已调试完毕的色谱工作站（如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置），使整个装置处于工作状态。
然后按实验要求吸取1.0毫升样液沿柱管内壁缓缓加入，加样完毕，打开层析柱底端出口，等样液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗涤。
（5）、洗涤方法：
a、洗涤柱内壁：取少量磷酸缓冲液（与上样量等体积），沿柱内壁四周缓缓加入柱内，加完毕，打开层析柱底端出口，等洗涤液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口。
重复上述方法洗涤柱内壁2次。
为防止冲坏床体表面，最后一次洗涤完毕后，将柱内洗涤溶液加至2-3cm高，连接柱上端端口与已调好流速的恒流泵。
b、洗涤吸附剂表面的杂质：继续用恒流泵以0.8ml/min的流速，自动洗涤至该条件下被洗涤的峰回到基线后10分钟止，停止洗涤。
洗涤完毕后，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内洗涤缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗脱。
（6）、洗脱方法：
为防止冲坏柱床体表面，先将柱内加洗脱溶液至2-3cm高，此时接上已调好流速的恒流泵进行自动洗脱。
当电脑屏幕出现的第二个洗脱峰回到基线后，继续洗脱10分钟，停止洗脱（约60—80分钟）。
（7）、保存和打印结果：
层析完毕，将结果保存到老师要求的文件夹中，并给出结论性的结果。
（8）、结束实验：
最后移去层析柱，回收柱内的葡聚糖凝胶，清洗层析柱和梯度混合仪装置，同时用恒流泵输送蒸馏水清洗所有与紫外检测仪相连的管道10分钟。
并将所有器皿也清洗干净，结束实验。