第五版分析化学第10章 吸光光度法2
合集下载
第10章 吸光光度分析
无机及分析化学
34
3、吸光度范围
被测溶液的吸光度值在0.2～0.8范围内，使测定
结果有较高的准确度，过大或过小应予以调节。 而当A= 0.434或T% = 36.8时，测定的误差最小。 为此可从以下三方面加以控制： 一是改变试样的称样量，或采用稀释、浓缩、富
无机及分析化学
12
质量吸光系数，摩尔吸光系数
• 质量吸光系数 a: 当一定波长的单色光，通过浓度 为 1g/L，吸收池的液层厚度为 1cm的溶液时，测 得的吸光度。单位为L.g-1.cm-1
• 摩尔吸光系数ε • 物理意义：当一定波长的单色光，通过浓度为 1mol/L，吸收池的液层厚度为1cm的溶液时，测 得的吸光度。单位为L.mol-1.cm-1
比耳定律假设了吸收粒子之间是无相互作用的， 因此仅在稀溶液（c < 10-2 mol/L )的情况下才适用。
(2)非单色光引起的偏离
朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但 在实际工作中，入射光是具有一定波长范围的。
无机及分析化学
18
化学因素
溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。
不同的显色反应的适宜 pH 是通过实验确定的。 无机及分析化学
24
3 、显色温度：要求标准溶液和被测溶液在测定 过程中温度一致。
4 、显色时间：通过实验确定合适的显色时间， 并在一定的时间范围内进行比色测定。
5、溶 剂：有机溶剂降低有色化合物的解离度， 提高显色反应的灵敏度。 6、共存离子的影响
无机及分析化学
偏离朗伯—比尔定律。
无机及分析化学
19
§10－2 显色反应及其影响因素
一、显色反应与显色剂
显色剂
显色反应：加入某种试剂使被测组分变成有色化合物的反应 在光度分析中生成有色物质的反应主要有配位反应、 氧化还原反应等，其中以配位反应应用最广。
无机及分析化学第十章吸光光度法
—比尔定律。
19
10.3 紫外—可见分光光度计及测定方法
10.3.1 分光光度计基本构造
光源：可见分光光度计都以钨灯（360~1000nm） 作光源。钨灯是6~12V的钨丝灯泡，仪器装有聚光透 镜使光线变成平行光，为保证光强度恒定不变，配 有稳压电源。紫外—可见分光光度计除有钨灯外其 光源还有氢灯，氢灯发射150~400nm波长的光，适用 于200 ~ 400nm波长范围的紫外分光光度法测定。
第十章 吸光光度法
1
10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6
概述 光的吸收定律——朗伯—比尔定律 紫外—可见分光光度计及测定方法 显色反应及其影响因素 测量条件的选择 紫外—可见分光光度法应用实例
2
学习要求
1．了解物质颜色与光的吸收关系 2．了解紫外—可见分光光度法的仪器和测量 条件 的选择 3．了解显色反应及其影响因素 4．熟悉紫外—可见分光光度法的实际应用 5．掌握朗伯—比尔定律及其偏离的原因 6．掌握紫外—可见分光光度法的测定方法
5
电磁波谱
6
10.1.2 物质的颜色与光的关系
•单色光:只具有一种波长的光。 •混合光 :由两种以上波长组成的光。 •白光:是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色 光按一定比例混合而成的。 •物质的颜色:是由于物质对不同波长的光具有选择 性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收 白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光 中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的颜色和吸 收的光颜色之间是互补关系。
21
吸收池：又称比色皿，是由无色透明的光学玻璃 或熔融石英制成，用于盛装试液或参比溶液。 玻璃吸收池：在见光范围内使用。 石英吸收池：在紫外光范围内使用。 吸收池，通常有0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm宽， 可适用于不同浓度范围的试样测定。同一组吸收 池的透光率相差应小于0.5%。
分析化学吸光光度法二
故T e 1 0.368, 即吸光度A 0.434时， 浓度测量的相对误差最小。
（二）测量条件的选择
选择适当的测量条件，是获得准确测定结 果的重要途径。择适合的测量条件，可从下列 几个方面考虑。 1.测量波长的选择 由于有色物质对光有选择性吸收，为了使 测定结果有较高的灵镀度和准确度，必须选择 溶液最大吸收波长的入射光。如果有干扰时， 则选用灵敏度较低但能避免干扰的入射光，就 能获得满意的酸度对被测物质存在状态的影响 大部分高价金属离子都容易水解，当溶液的酸度 降低时，最终将导致沉淀的生成。显然，金属离子的 水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度 不能太低。
(2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响 光度分析中所用的大部分显色剂都是有 机弱酸。 M + HR＝MR + H+ 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着 显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程 度。
3.时间和温度 显色反应的速度有快有慢。实验方法是配制一份显色溶 液，从加入显色剂计算时间、每隔几分钟测定一次吸光度， 绘制A-t曲线，根据曲线来确定适宜的时间。 不同的显色反应需要不同的温度，一般显色反应可在室温 下完成。但是有些显色反应需要加热至一定的温度才能完成； 也有些有色络合物在较高温度下容易分解。因此，应根据不 同的情况选择适当的温度进行显色。温度对光的吸收及颜色 的深浅也有一定的影响，故标样和试样的显色温度应保持一 样。合适显色温度也必须通过实验确定 ,做A-C曲线即可求出。
(3)对络合物组成和颜色的影响 对于某些逐级形成络合物的显色反应、在不 同的酸度时，生成不同络合比的络合物。例如铁 与水杨酸的络合反应，当 pH＜4 [Fe3+(C7H4O3)2-]+ 紫色 4＜pH＜9 [Fe3+(C7H4O3)22-]- 红色 pH＞9 [Fe3+(C7H4O3)32-]3- 黄色 在这种情况下，必须控制合适的酸度，才可 获得好的分析结果。 合适酸度也必须通过实验确定,做A-pH曲线即可 求出
武汉大学分析化学第五版第10章：吸光光度法
而且颜色深浅与浓度有关
吸光光度法
定义：是基于被测物质对光具有选择性吸收的特性而
建立的分析方法。 包括：比色法、可见及紫外吸光光度法、红外光谱法
等。本章我们重点讨论可见光区的吸光光度法。
特点
• 灵敏度高 最低浓度一般可达1-10-3%的微量组分。对 固体试样一般可测到10-4%。如果对被测组分事先加以 富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。 • 准确度较高 相对误差为2-5%，但对微量成分来说， 还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重 量法也不够准确了，甚至无法进行测定。
/
A 0.19 ε= —— = = 1.1×104L· -1· -1 mol cm bc 2×8.95 ×10-6
5.桑德尔灵敏度S
当光度检测器的检测极限为A=0.001时，单位截面 积光程内所能检测出来的吸光物质最低含量（ 单位： μg/cm2 ）。
0.001 A =0.001 =ε· c b· cb= —— ε 0.001 M 3 = —— (μg/cm2) S= ——— ×M ×10 ε ε mol cm 所以上式中的灵敏度： ε单位：L· -1· -1 M 55.85 S = — = ———— = 0.005μg/cm2 ε 1.1×104
3.影响ε值大小的因素
(1)入射光波长 (2)与被测物质有关 (FeSCN ， ε=200 ； 4 Fe phen 1.1 ×10 ) (3)温度，酸度，介质，有色物结构 (4)ε不随 c或A值变化
4.ε值的计算
小结：
a，ε与c或A无关
εmax≥104L• mol-1 • cm-1 用光度法测定具有较高
(4)不同物质的吸收曲线形状不同，决定了 物质的结构分析的依据 ，即定性依据 (5)若选择在λmax处测量A，则灵敏度高 (6)从吸收光谱曲线得出结论：c愈大，颜色 愈深，吸收光愈强，Ia愈大，透光It愈弱；c愈小 ，则相反 c增大 A增加 T减小 ε值不变 λmax不变
分析化学讲义第10章吸光光度法a (2)
透光率 （透射比）Transmittance
入射光 I0
透射光 It
透光率定义：
T
It
I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 %
吸收定律的数学表达式：
AKcb
★ 朗伯-比尔定律表明：当一束平行单色光通过含有吸光物
质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚 度成正比。这是进行定量分析的理论基础。比例常数K与 吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。
光的波粒二象性
波动性
粒子性
E
光的折射 光的衍射 光的偏振 光的干涉
光电效应
E
h
hc
E：光子的能量（J, 焦耳） ：光子的频率（Hz, 赫兹） ：光子的波长（cm） c：光速（2.99791010 cm.s-1） h：Plank常数（6.625610-34 J.s 焦
耳. 秒）
单色光、复合光、光的互补
K：比例常数
Hale Waihona Puke 物质的性质 入射光波长c：mol / L c：g / L
取值与浓度的单位相关
K 摩尔吸光系数， L ·mol –1 ·cm -1
Molar Absorptivity Acb
Ka
吸光系数， L ·g –1 ·cm -1
Absorptivity Aacb
a
M
摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度
(三)操作简便，测定速度快
(四)应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化合物都可 直接或间接地用吸光光度法进行测定。
1.2 光的基本性质
光的电磁波性质
10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm
分析化学(第五版) 第10章 吸光光度法
第10章 吸光光度法 章
10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度计 10.4 显色反应及影响因素 10.5 光度分析法的设计 10.6 吸光光度法的误差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的应用
10.1 概述 吸收光谱 发射光谱 散射光谱 分子光谱 原子光谱
吸光光度法：分子光谱分析法的一种， 吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光 度法， 度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁
e 溶剂 有机溶剂，提高灵敏度、 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 f 干扰离子 消除办法： 消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂， 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比 铬天菁S测 ，氟化铵褪色，消除锆、 钴干扰) 褪色空白(铬天菁 测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰 选择适当波长
10.5 光度分析法的设计
2 物理化学因素 非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射， 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测 吸光度增加， 吸光度增加，导致线性关系上弯 化学反应 离解、缔合、 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42PAR的偶氮－醌腙式 的偶氮－ 的偶氮
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及 某些化学反应平衡常数的测定
10.3 吸光光度计
1 分光光度计的组成
读出系统 光源 单色器 样品池 检测器
常用光源
光源 氢灯 氘灯 钨灯 卤钨灯 氙灯 能斯特灯 空心阴极灯 激光光源 波长范围(nm) 185~375 185~400 320~2500 250~2000 180~1000 1000~3500 特有 特有 适用于 紫外 紫外 可见，近红外 紫外，可见，近红外 紫外、可见（荧光） 红外 原子光谱 各种谱学手段
10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度计 10.4 显色反应及影响因素 10.5 光度分析法的设计 10.6 吸光光度法的误差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的应用
10.1 概述 吸收光谱 发射光谱 散射光谱 分子光谱 原子光谱
吸光光度法：分子光谱分析法的一种， 吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光 度法， 度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁
e 溶剂 有机溶剂，提高灵敏度、 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 f 干扰离子 消除办法： 消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂， 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比 铬天菁S测 ，氟化铵褪色，消除锆、 钴干扰) 褪色空白(铬天菁 测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰 选择适当波长
10.5 光度分析法的设计
2 物理化学因素 非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射， 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测 吸光度增加， 吸光度增加，导致线性关系上弯 化学反应 离解、缔合、 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42PAR的偶氮－醌腙式 的偶氮－ 的偶氮
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及 某些化学反应平衡常数的测定
10.3 吸光光度计
1 分光光度计的组成
读出系统 光源 单色器 样品池 检测器
常用光源
光源 氢灯 氘灯 钨灯 卤钨灯 氙灯 能斯特灯 空心阴极灯 激光光源 波长范围(nm) 185~375 185~400 320~2500 250~2000 180~1000 1000~3500 特有 特有 适用于 紫外 紫外 可见，近红外 紫外，可见，近红外 紫外、可见（荧光） 红外 原子光谱 各种谱学手段
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
分析化学-吸光光度法
2010.3
分析化学（2010)
CYJ 9
Analytical Chemistry 分析化学
互 补 色 示 意 图
绿
500-580
黄
580-600
青
490-500
橙
600-650
白光
青蓝
480-490
红
650-750
蓝 紫
400-450
分析化学（2010)
450-480
2010.3
CYJ 10
Analytical Chemistry 分析化学
Analytical Chemistry 分析化学
吸光光度法
定义： 具有选择性 定义：是基于被测物质的 分子 对 光 具有选择性 的特性而建立的分析方法。 吸收的特性而建立的分析方法 吸收的特性而建立的分析方法。 包括：比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱 包括：比色法、 法等。本章我们重点讨论可见光区 可见光区的吸光光度 法等。本章我们重点讨论可见光区的吸光光度 法。
2010.3 分析化学（2010) CYJ 2
Analytical Chemistry 分析化学
化学分析与仪器分析方法比较
化学分析：常量组分 化学分析：常量组分(>1%)，Er 0.1%-0.2% ， 依据化学反应， 依据化学反应， 使用玻璃仪器
准确度高
灵敏度高 仪器分析：微量组分 仪器分析：微量组分(<1%)， Er 2%-5% ， 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器 依据物理或物理化学性质
分析化学（2010) CYJ 7
粒子性
2010.3
Analytical Chemistry 分析化学
2、光谱分区 、
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1. 示差吸光光度法的原理 (高浓度) 常规法: 以试剂空白为参比
A bCx
示差法: 以浓度为 Cs 的标准溶液为参比 (Cs＜Cx)
Ax As b(Cx Cs )
△A △A
A bCx
示差法定量依据
Cx Cx Cs
△Cx △C
2. 示差吸光光度法的误差
0 5 10 50 100
AR K a AHR [ H ] A [H ] Ka [H ] Ka
AHR A Ka [H ] A AR
A AR pKa pH lg AHR A
说明：AHR ——酸性溶液中全部以HR存在时的吸光度 AR ——碱性溶液中全部以R存在时的吸光度 A ——某pH下HR+R的吸光度 且三个吸光度的测定波长相同
10.2 分光光度计及吸收光谱
10.2.1 分光光度计
单波长单光束分光光度计示意图
0.575
光源
单色器
样品池
检测器
数据处 理装置
光源
氢灯，氘灯：185 ~ 350 nm; 钨灯：250 ~ 2000 nm。 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定。
单色器
作用：将复合光色散成单色光 棱镜: 玻璃 350 ~ 2500 nm；石英 185 ~ 4500 nm 光栅:
A: 0.2~0.8
T = 36.8 %，A = 0.434 时误差最小。
10.5 其他吸光光度法
10.5.1 目视比色法
用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。
标准系列
特点: 利用自然光 比较的是透过光的强度 准确度低（半定量） 不可分辨多组分
未知样品
方法简便，灵敏度高
10.5.2 示差吸光光度法
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O
离子缔合物 AuCl4--罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
10.3.2 影响显色反应的因素 a. 溶液酸度（pH值及缓冲溶液） b. 显色剂的用量 c. 显色反应时间 d. 显色反应温度 e. 溶剂 f. 干扰离子
2. 络合物组成的测定
（1）饱和法（摩尔比法）
M + nR = MRn
① 固定CM，改变CR，使其从 0 开始增大，
配制系列标准溶液。
② 以试剂空白为参比在特定波长测定A。 ③ 以 A 对 CR/CM 作图。 A
n
CR/CM
（2）连续变化法（等摩尔系列法） M + nR = MRn
① 固定CM+ CR =C （CM / C 从 0 →1）， 配制系列标准溶液。 ② 在络合物的 max 处测定A。 ③ 以 A对 CM/C 作图 , 求得 CR / CM =n。
Cx
C
标准曲线不过原点的原因: 参比溶液选择不当，
A
参比与待测液的吸收池厚度不等，
吸收池位置不妥， 吸收池透光面不清洁等， 被测物质在低浓度时显色不完全等。
0 C
10.4.2 对朗伯-比尔定律的偏离
正偏离
1. 非单色光引起的偏离
2. 介质不均匀引起的偏离
A
负偏离 0 C
3. 由于吸光物质本身的化学反应引起的偏离 A 解离 B 络合
A
CM / C =0.5，n = 1 CM / C =0.33，n = 2
0
0.33 0.5
1.0 CM / C
3. 分析应用 痕量金属分析
临床分析
食品分析
显色反应的要求：
a. 选择性好
b. 灵敏度高 (ε>104)
c. 产物的化学组成稳定
d. 化学性质稳定
e. 反应物和产物有明显的颜色差别 (λ>60 nm)
2. 显色剂
无机显色剂:
过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾 有机显色剂： 磺基水杨酸，丁二酮肟，1,10-邻二氮菲， 二苯硫腙等
3. 多元络合物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
样品池
玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大。 光电管，光电倍增管等。
检测器
显示器及数据处理装置
记录仪、数字显示、计算机等。
UV-2450/2550 （岛津）
U-2910（日立）
10.2.2 吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长 （）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波 长的变化曲线，即为吸收光谱。 1. 最大吸收波长λmax ：光吸收程度 最大处的波长。 2. 同一物质浓度增加时，吸收曲线 形状相同，λmax不变，吸光度增大。
常规法
T
Tx
示差法 T
0 5 10
Ts
50 100
P338：习题8
10.5.3 双波长光度法
P329
10.5.4 导数光度分析法 P331
10. 6 吸光光度分析法的应用
1. 弱酸弱碱离解常数的测定 HR = H+ + RC= [HR] + [R]
(1) 配制高酸度、高碱度、某 pH 条件下总浓度 C 相同的三份 A HR 溶液。 (2) 绘制酸式 HR 或碱式 R- 的吸 收曲线，选择最佳吸收波长。 (3) 在该波长处，测某 pH 条件下 HR溶液的吸光度A。
dT dA 0.434 T
因此，测量误差与透光率读数范围的关系：
dT dA 100 % Er 100 % T ln T A T Er 100 % T ln T
△T为透光率读数的绝对误差，一般为± 0.01。
Er-T 关系图： Er ≤±4%时:
T: 15%~65 %
可见光光度法：
测定的物质要有颜色
参比溶液的选择 参比的作用：扣除非待测组分的吸收。 （利用参比溶液来调节仪器的零点）
A 总 = A 待测物 + A 干扰 + A 池
令 A 参比 = A干扰 + A 池 = 0
参比溶液的选择：P318
10.3 显色反应及其影响因素（了解）
10.3.1 显色反应和显色剂 1. 显色反应 待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的 试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定， 此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。 显色反应的类型：主要有氧化还原反应和络合反应 两大类，而络合反应是最主要的。
C 缔合
4. 显色反应的干扰及其消除：P325
10.4.3 吸光度测量的误差
吸光度标尺刻度不均匀，吸光度的读数误差即 为浓度的测量误差，故吸光度应控制一定的读数范围。
dA dc Er 100% 100% A c
透光率读数的绝对误差是均匀的
A lg T 0.434 ln T
10.4 吸光光度分析及误差控制 10.4.1 测量波长和标准曲线的制作
1. 测量波长的选择 无干扰: 选择 max
A
有干扰: 干扰最小，吸收最大
A
2. 标准曲线的制作
定量方法: 标准曲线法
标准曲线的制作: 配制系列待测物标准溶液: 相同条件下测吸光度:
A Ax 0
C1、C2…Cn A1、A2…An
HR
R
HR
R
A HR b[ HR] Rb[ R]
根据分布系数的概念
CK a C[ H ] A HR b Rb [H ] Ka [H ] Ka
(4) 当高酸度时， [HR] ≈ C，则AHR ≈ εHRbC。
(5) 当低酸度时， [R] ≈ C，则AR ≈ εRbC。
A bCx
示差法: 以浓度为 Cs 的标准溶液为参比 (Cs＜Cx)
Ax As b(Cx Cs )
△A △A
A bCx
示差法定量依据
Cx Cx Cs
△Cx △C
2. 示差吸光光度法的误差
0 5 10 50 100
AR K a AHR [ H ] A [H ] Ka [H ] Ka
AHR A Ka [H ] A AR
A AR pKa pH lg AHR A
说明：AHR ——酸性溶液中全部以HR存在时的吸光度 AR ——碱性溶液中全部以R存在时的吸光度 A ——某pH下HR+R的吸光度 且三个吸光度的测定波长相同
10.2 分光光度计及吸收光谱
10.2.1 分光光度计
单波长单光束分光光度计示意图
0.575
光源
单色器
样品池
检测器
数据处 理装置
光源
氢灯，氘灯：185 ~ 350 nm; 钨灯：250 ~ 2000 nm。 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定。
单色器
作用：将复合光色散成单色光 棱镜: 玻璃 350 ~ 2500 nm；石英 185 ~ 4500 nm 光栅:
A: 0.2~0.8
T = 36.8 %，A = 0.434 时误差最小。
10.5 其他吸光光度法
10.5.1 目视比色法
用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。
标准系列
特点: 利用自然光 比较的是透过光的强度 准确度低（半定量） 不可分辨多组分
未知样品
方法简便，灵敏度高
10.5.2 示差吸光光度法
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O
离子缔合物 AuCl4--罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
10.3.2 影响显色反应的因素 a. 溶液酸度（pH值及缓冲溶液） b. 显色剂的用量 c. 显色反应时间 d. 显色反应温度 e. 溶剂 f. 干扰离子
2. 络合物组成的测定
（1）饱和法（摩尔比法）
M + nR = MRn
① 固定CM，改变CR，使其从 0 开始增大，
配制系列标准溶液。
② 以试剂空白为参比在特定波长测定A。 ③ 以 A 对 CR/CM 作图。 A
n
CR/CM
（2）连续变化法（等摩尔系列法） M + nR = MRn
① 固定CM+ CR =C （CM / C 从 0 →1）， 配制系列标准溶液。 ② 在络合物的 max 处测定A。 ③ 以 A对 CM/C 作图 , 求得 CR / CM =n。
Cx
C
标准曲线不过原点的原因: 参比溶液选择不当，
A
参比与待测液的吸收池厚度不等，
吸收池位置不妥， 吸收池透光面不清洁等， 被测物质在低浓度时显色不完全等。
0 C
10.4.2 对朗伯-比尔定律的偏离
正偏离
1. 非单色光引起的偏离
2. 介质不均匀引起的偏离
A
负偏离 0 C
3. 由于吸光物质本身的化学反应引起的偏离 A 解离 B 络合
A
CM / C =0.5，n = 1 CM / C =0.33，n = 2
0
0.33 0.5
1.0 CM / C
3. 分析应用 痕量金属分析
临床分析
食品分析
显色反应的要求：
a. 选择性好
b. 灵敏度高 (ε>104)
c. 产物的化学组成稳定
d. 化学性质稳定
e. 反应物和产物有明显的颜色差别 (λ>60 nm)
2. 显色剂
无机显色剂:
过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾 有机显色剂： 磺基水杨酸，丁二酮肟，1,10-邻二氮菲， 二苯硫腙等
3. 多元络合物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
样品池
玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大。 光电管，光电倍增管等。
检测器
显示器及数据处理装置
记录仪、数字显示、计算机等。
UV-2450/2550 （岛津）
U-2910（日立）
10.2.2 吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长 （）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波 长的变化曲线，即为吸收光谱。 1. 最大吸收波长λmax ：光吸收程度 最大处的波长。 2. 同一物质浓度增加时，吸收曲线 形状相同，λmax不变，吸光度增大。
常规法
T
Tx
示差法 T
0 5 10
Ts
50 100
P338：习题8
10.5.3 双波长光度法
P329
10.5.4 导数光度分析法 P331
10. 6 吸光光度分析法的应用
1. 弱酸弱碱离解常数的测定 HR = H+ + RC= [HR] + [R]
(1) 配制高酸度、高碱度、某 pH 条件下总浓度 C 相同的三份 A HR 溶液。 (2) 绘制酸式 HR 或碱式 R- 的吸 收曲线，选择最佳吸收波长。 (3) 在该波长处，测某 pH 条件下 HR溶液的吸光度A。
dT dA 0.434 T
因此，测量误差与透光率读数范围的关系：
dT dA 100 % Er 100 % T ln T A T Er 100 % T ln T
△T为透光率读数的绝对误差，一般为± 0.01。
Er-T 关系图： Er ≤±4%时:
T: 15%~65 %
可见光光度法：
测定的物质要有颜色
参比溶液的选择 参比的作用：扣除非待测组分的吸收。 （利用参比溶液来调节仪器的零点）
A 总 = A 待测物 + A 干扰 + A 池
令 A 参比 = A干扰 + A 池 = 0
参比溶液的选择：P318
10.3 显色反应及其影响因素（了解）
10.3.1 显色反应和显色剂 1. 显色反应 待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的 试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定， 此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。 显色反应的类型：主要有氧化还原反应和络合反应 两大类，而络合反应是最主要的。
C 缔合
4. 显色反应的干扰及其消除：P325
10.4.3 吸光度测量的误差
吸光度标尺刻度不均匀，吸光度的读数误差即 为浓度的测量误差，故吸光度应控制一定的读数范围。
dA dc Er 100% 100% A c
透光率读数的绝对误差是均匀的
A lg T 0.434 ln T
10.4 吸光光度分析及误差控制 10.4.1 测量波长和标准曲线的制作
1. 测量波长的选择 无干扰: 选择 max
A
有干扰: 干扰最小，吸收最大
A
2. 标准曲线的制作
定量方法: 标准曲线法
标准曲线的制作: 配制系列待测物标准溶液: 相同条件下测吸光度:
A Ax 0
C1、C2…Cn A1、A2…An
HR
R
HR
R
A HR b[ HR] Rb[ R]
根据分布系数的概念
CK a C[ H ] A HR b Rb [H ] Ka [H ] Ka
(4) 当高酸度时， [HR] ≈ C，则AHR ≈ εHRbC。
(5) 当低酸度时， [R] ≈ C，则AR ≈ εRbC。