保健食品增强免疫力的评价方法
《保健食品功能检验与评价技术指导原则(2022年版)》
附件2保健食品功能检验与评价技术指导原则（2022年版）表述更加科学严谨，通俗易懂，能够被消费者正确理解认知，避免与药品的疾病预防、治疗作用混淆。
（二）取消“促进泌乳” “抑制肿瘤”等保健功能，不再纳入目录。
现有27种保健功能中，促进泌乳功能、改善生长发育功能、改善皮肤油份功能3种保健功能与现行的保健食品功能定位、消费者的健康需求不符，准予注册的产品数量极少，特别是促进泌乳涉及哺乳期妇女等特殊人群，改善生长发育存在人为干预少年儿童生长发育的疑虑，因此不再纳入目录。
另外，原卫生部批准的抑制肿瘤、辅助抑制肿瘤、抗突变、延缓衰老等保健功能涉及疾病预防治疗和“神药"，不符合现行食品安全法和保健功能定位，卫生部时期已不再受理审批，不再纳入允许保健食品声称的保健功能目录。
三、《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》的定位《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》（以下简称《评价方法（2022年版）》）所列方法为目录配套的检验与评价方法，由强制性方法改为推荐性方法。
为落实企业研发主体责任，充分发挥社会资源科研优势，提高功能评价方法的科学性和企业开展保健功能基础研究的积极性，提高保健功能目录制定质量和效率。
依据《目录管理办法》，任何个人、企业、科研机构和社会团体在科学研究论证的基础上，均可提出纳入或调整保健功能目录的建议。
主管部门按程序要求组织审查、公开论证，符合要求的就可以纳入或调整功能目录。
对于已纳入《功能目录》的保健功能，任何个人、企业、科研机构和社会团体在科学研究论证的基础上，可以提出新的功能评价方法，参照功能目录的纳入程序，认可作为功能评价推荐性方法后，可供注册使用。
四、新旧保健功能声称与评价衔接管理（一）保健功能声称的衔接《功能目录》自公告发布之日起实施，已发布的《保健食品原料目录》的功效自动对应调整。
已纳入《功能目录》的新旧保健功能声称的调整和衔接要求详见附表。
其中，对于不需要重做或补做功能学试验项目的，已处于受理审评审批过程中的产品，技术审评机构将直接调整保健功能声称及说明书相关内容，申请人无需补正。
保健食品功能检验与评价技术指导原则(2023年版)
保健食品作为一类具有特定保健功能的食品，在保障公众健康、满足特定人裙营养需求等方面发挥着重要作用。
为了规范保健食品的功能检验与评价工作，确保保健食品的安全性和有效性，国家相关部门不断修订和完善保健食品功能检验与评价技术指导原则。
2023 年版的保健食品功能检验与评价技术指导原则的出台，具有重大的意义和深远的影响。
一、新版指导原则的背景与意义随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，保健食品市场呈现出蓬勃发展的态势。
然而，市场上也存在一些保健食品夸大宣传功效、质量参差不齐等问题，给用户的健康带来潜在风险。
为了加强对保健食品的监管，保障公众的合法权益，制定科学、严谨、可行的保健食品功能检验与评价技术指导原则势在必行。
新版指导原则在总结以往经验的基础上，结合了国内外最新的研究成果和监管要求，进一步明确了保健食品功能检验与评价的方法、标准和程序。
它的出台有利于规范保健食品的研发、生产和销售环节，提高保健食品的质量和安全性，促进保健食品行业的健康发展。
也为用户正确选择和使用保健食品提供了科学依据，增强了用户对保健食品的信任度。
二、新版指导原则的主要内容（一）保健食品功能评价方法的完善新版指导原则对保健食品的功能评价方法进行了系统的梳理和完善。
明确了不同功能类别的保健食品应采用的主要评价方法，如增强免疫力功能评价可采用小鼠免疫功能试验、血清溶血素测定等；改善睡眠功能评价可采用小鼠睡眠剥夺试验、脑电图分析等。
对评价方法的操作步骤、数据采集和分析要求等进行了详细规定，确保评价结果的准确性和可靠性。
新版指导原则还强调了多指标综合评价的理念，鼓励在功能评价中综合考虑多个生理指标和生化指标的变化，以更全面地评估保健食品的功能效果。
这有助于克服单一指标评价的局限性，提高评价的科学性和客观性。
（二）保健食品原料的质量要求保健食品的功效与原料的质量密切相关。
新版指导原则对保健食品原料的质量提出了更高的要求。
要求原料应符合国家相关标准和规定，具有明确的来源、质量控制指标和检验方法。
保健品检测卫生检验
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三、有毒有害物质免疫学检测的应用
(一)残留农药的检测
1. ELISA法
应用：检测食品、土壤、水中残留的有机氯、有机磷、甲 苯胺、滴灭威、多菌灵、百草枯、拟除虫菊酯，三嗪类等 杀虫剂、除草剂等。
优点：比用气相色谱或高效液相色谱方法所用的试剂费 要低20倍，对样品的处理方法也比较简单，且两者的最 低检出限及回收率均吻合。
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（二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳 肿胀法）
1．原理 二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将
其稀释液涂抹小鼠腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结 合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致 敏淋巴细胞。4 d～7d 后再将其涂抹于耳部， 使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击 后24h～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。
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前言
保健食品功能的试验和评价的项目从原来的 22项增加到27项，主要有增强免疫功能，辅助降 血脂功能，辅助降血糖功能，抗氧化功能，辅 助改善记忆功能，缓解疲劳功能，促进排铅功 能等等，保健食品的免疫学检验，主要用于对 其增强免疫力功能的验证与评价。
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对受试样品处理的要求 受试样品推荐源自较大，超过灌胃量，可以适 当减少样品中非功效成分的含量，或浓缩。 如：60-70℃减压浓缩。
对合理设置对照组的要求 以载体和功效成分组成的受试样品，当载体 本身可能具有相同功能时，应将该载体作为 对照。
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4. 然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中。
第2章 保健食品功能学评价程序和检验方法规范
• （七）安全性评估意见的内容、格式及结论应当符 合《食品安全风险评估管理规定》的有关规定；
检测机构及所承接的检测项目
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保健食品注册检验机构名单
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 北京市疾病预防控制中心 天津市疾病预防控制中心 河北省疾病预防控制中心 辽宁省疾病预防控制中心 吉林省疾病预防控制中心 黑龙江省疾病预防控制中心 上海市疾病预防控制中心 江苏省疾病预防控制中心 浙江省疾病预防控制中心 福建省疾病预防控制中心 山东省疾病预防控制中心 河南省疾病预防控制中心 湖北省疾病预防控制中心 湖南省疾病预防控制中心
相关管理法规和标准
《中华人民共和国食品卫生法》
• 第七十七条 依法应当注册的保健食品，注册时 应当提交保健食品的研发报告、产品配方、生产 工艺、安全性和保健功能评价、标签、说明书等 材料及样品，并提供相关证明文件。
• 国务院食品药品监督管理部门经组织技术审评， 对符合安全和功能声称要求的，准予注册；
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国家安全风险评估中心等单位保健食品注册检验 机构及检验项目
号 检验机构 名称
注册检验项目范围
011
国
家食品
安全风
险评估
中心
安全性毒理学试验、功能学动物试验（1、增强免疫力功能 2、 辅助降血脂功能3、辅助降血糖功能4、抗氧化功能5、辅助改善记忆 功能6、促进排铅功能7、清咽功能8、辅助降血压功能9、改善睡眠 功能10、促进泌乳功能11、缓解体力疲劳功能12、提高缺氧耐受力 功能13、对辐射危害有辅助保护功能14、减肥功能15、改善生长发 育功能16、增加骨密度功能17、改善营养性贫血功能18、对化学性 肝损伤有辅助保护功能19、调节肠道菌群功能20、促进消化功能21、 通便功能22、对胃粘膜损伤有辅助保护功能）、功效成分或标志性 成分检测、卫生学试验、稳定性试验、复核检验
第三章 功能性食品评价原理和方法
第三章功能性食品评价原理和方法功能性食品评价既包括对普通食品应做的评价，即卫生学评价和稳定性评价；又包括功能学评价，即功能食品区别于普通食品（含绿色食品）的根本内容，也是各国政府实施行政管理的核心问题。
功能性食品在进行功能学评价之前，先要进行毒理学评价。
第一节毒理学评价毒理学评价，是对功能食品进行功能学评价的前提。
功能性食品或其功效成分，首先必须保证食用安全性。
原则上必须完成卫生部《食品安全性毒理学评价程序和方法》中规定的第一、二阶段的毒理学试验，必要时需进行更深入的毒理学试验。
但以普通食品原料和（或）药食两用（我国卫生部公布的既是食品，又是药品的原料资源）原料作为资源的功能性食品，可以不做毒理学试验。
一、毒理学评价的四个阶段第一阶段：急性毒性试验，包括经口急性（LD50）和联合急性毒性。
第二阶段：遗传毒性试验、传统致畸试验和短期喂养试验。
遗传毒性试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞、体内和体外试验相结合的原则。
具体试验项目包括：①细菌致突变试验：鼠伤寒沙门氏菌／哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）为首选项目，必要时可另选其他试验。
②小鼠骨髓微核率：测定或骨髓细胞染色体畸变分析。
③小鼠精子畸形分析和睾丸染色体畸变分析。
④其他备选遗传毒性试验、：V79／HGPRT基因突变试验、显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、程序外DNA修复合成（UDS）试验。
⑤传统致畸试验。
⑥短期喂养试验：30d喂养试验。
如受试物需进行第三、四阶段毒性试验者，可不进行本试验。
第三阶段：亚慢性毒性试验（90d喂养试验）、繁殖试验和代谢试验。
第四阶段：慢性毒性试验和致癌试验。
凡属我国创新的物质，一般要求进行四个阶段的试验。
特别是对其中化学结构提示有慢性毒性、遗传毒性、致癌性的，或产量大、使用泛围广的，必须进行四个阶段的试验。
凡属与已知物质（指经过安全性评价并允许使用）化学结构基本相同的衍生物或类似物，根据第一、二、三阶段的毒性试验结果，判断是否需进行第四阶段的试验。
保健食品的定义与评价
中药类保健食品著作和发表年代
食物疗病法1917 诸病食养疗法1926 现代食疗本草1930 食物治病新书1932 补品研究1937 食物疗病常识1937 家庭食物疗病法1940 疾病饮食指南1938 食物疗病法1940
中国传统保健食品的历史改革和特点
1 “医食同源”理论-——保健食品的起源。 2 变生食为熟食——-保健食品的前 提
特别注意： 药品的毒副作用
我国保健食品产业发展状况
消费者
保健食品 1 2 产业
1消费者
1）迷信广告，跟风追“名贵”，
1
消费者对保健食 品缺乏科学认识
2)盲从的社会心理。模仿因素、感染因素和从众因素均成为人们竞 相购买 3）混淆食品、保健食品和药品的界限。健食品的社会心理原因。
2
消费者对滥用保 健食品的危害认识 不足
我国保健食品的发展经历了三个阶段
初级保健食品, 仅根 据食物中的营养成分 或强化的营养素来推 第二代保健食品 知该类食品的功能 需经过动物或 第一代保健食品 人体实验证明 其生理调节功 能
第三代保健食品
1需经过动物或 人体实验证明其 生理调节功能
2需确知其功效 成分的化学结构 及其含量
中药作用机制
3 发明汤液——保健食品的重要剂型
4 酒，保健酒——百药之长 5 中药，尤其是食药两用的中 药——保健食品的重要成分 6 中国的宫廷保健食品—— 保健食品的精华
如何选择合适的保健品
通过膳食评价或人体测量以及具体的实验室指标来确定人体所 缺乏的营养素
选择保健品的原则是，日常饮食中缺少哪种营养素就针对性地 补充哪种。
9、其他类：二十八醇、植物甾醇、皂甙(苷)等。
保健品
保健食品各功能需要做的动物及人体试验
保健食品各功能需要做的动物及人体试验（一）只要求动物实验的项目有：1. 增强免疫力功能检验方法主要指标：细胞免疫功能体液免疫功能单核－巨噬细胞功能NK细胞活性测定判定：四项指标中任两项结果阳性。
注意事项：不认可增强单项免疫力功能。
2. 改善睡眠功能检验方法主要指标：戊巴比妥纳睡眠时间实验巴比妥钠睡眠潜伏期实验戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验判定：3项实验中任2项阳性，且直接睡眠作用。
注意事项：对动物进行直接睡眠实验时，也要同样注意进行30天灌胃。
3. 缓解体力疲劳检验方法主要指标：血乳酸血清尿素肝糖原/肌糖原动物负重游泳实验判定：负重游泳实验结果阳性，血乳酸曲线下面积、血清尿素、肝糖/肌糖原3项生化指标中任2项指标阳性。
注意事项：（1）对同批受试样品进行违禁药物的检测。
（2）在负重游泳实验时，酒类样品测试当天可以不灌胃。
4. 提高缺氧耐受力功能检验方法主要指标：常压耐缺氧实验亚硝酸钠中毒存活实验急性脑缺血性缺氧实验判定：三项试验中任二项实验结果阳性。
注意事项：每批实验动物的体重尽量保持一致。
5. 对辐射危害有辅助保护功能检验方法主要指标：外周血白细胞计数骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数小鼠骨髓细胞微核实验血/组织中SOD活性实验血清溶血素含量实验判定：以上5项实验中任3选项进行实验，3项实验中任何2项实验结果阳性。
注意事项：选用小鼠，受试样品于照射前给予14～30天，照射后仍然给予受试物，必要时可延至45天。
6. 增加骨密度功能检验方法根据受试样品作用的原理不同，分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。
主要指标：体重骨钙含量骨密度判定：（方案一）骨钙含量/骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量的碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组。
（方案二）①不含钙的产品：骨钙含量/骨密度较模型对照组明显增加，其它指标（体重除外）不显著低于卵巢切除＋溶剂组。
保健食品功能评价方法
• 眼部症状 • 明视持久度 • 远视力
• 随机、双盲分组，视力水 平均衡
• 对照组用安慰剂
• 症状总积分、明视持久度 和总有效率明显改善
• 平均明视持久度提高大于 等于10%
• 可判定该受试样品具有缓 解视疲劳的作用
促进排铅作用动物实验
• 体重 • 血铅 • 骨铅 • 肝组织铅
• 动物模型成立
• 实验组与模型对照组比较， 肝组织铅或骨铅含量明显下 降
保健功能
• 特定保健功能声称 • 特定人群食用 • 调节机体功能、抵御环境有害
因素、补充营养、缓解某些病 理状况 • 不以治疗疾病为目的
1. 增加免疫力* 12. 缓解体力疲劳* 21.祛黄褐斑
2. 辅助降血脂 13. 提高缺氧耐受力* 22.改善皮肤水份
3. 辅助降血糖 14. 对辐射危害有辅 23.改善皮肤油份
增加免疫力试验项目
体重 脏器/体重比值：胸腺/体重，脾脏/体重 • 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型
变态反应实验 • 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测
定 • 单核—巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹
腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 • NK细胞活性测定
增加免疫力结果判定
径受试样品的给予量 • 测量每日饲料消耗量/饮水量，计算食物利用率
对实验动物的要求
• 各种实验的具体要求，合理选择实验动物 • 动物的性别、年龄依实验需要进行选择 • 动物的数量要求为小鼠每组10－15只（单一性别），大
鼠每组8－12只（单一性别） • 动物应达到清洁级实验动物的要求 • 动物合格证
满足上述两个条件
餐后2h血糖 ①试验组自身比较，差异显 著，且试验后平均血糖下降 ≥10％ ②试食组与对照组比较，血 糖值下降或血糖下降百分率 差异显著
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保健食品增强免疫力的评价方法
一、实验内容：
1.细胞免疫
2.体液免疫
3.非特异性免疫功能
4.NK细胞活性
二、评价指标
1.体重和免疫脏器重量的测定：
称量实验动物在实验的初，中，终期的体重，测量胸腺和脾脏重量，评价受试动物的一般情况，脏器/体重比，包括胸腺/体重比，脾脏/体重比
2.细胞免疫功能测定：
1)小鼠脾淋巴细胞转化实验
2)迟发性超敏反应（DTH）
3.体液免疫功能
1)抗体生成细胞检测
2)血清溶血素测定
4.单核/巨噬细胞功能测定
1)小鼠廓清实验
2)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
5.NK细胞活性测定
三、动物选择
1.正常或免疫功能低下的模型动物进行实验。
2.一般选择小鼠，品系不限，推荐使用近郊系动物，性别为单一性，6-8W，体
重18-22g。
3.动物数量每组10-15只，清洁级以上。
四、实验剂量
1.至少设3个剂量组，另设空白对照组，也可加阳性对照组。
2.尽可能找出最低有效剂量。
3.3个剂量中，有1个剂量应相当于人体推荐摄入量（折算为每公斤体重的剂
量）的10倍
4.最高剂量不得高于人体推荐摄入量的30倍
5.剂量必须在毒理学评价的安全剂量范围内
五、实验时间
一般30天
六、结果判定
1.细胞免疫功能
小鼠脾淋巴细胞转化实验和DTH反应实验结果均为阳性，或其中一个实验的两个剂量组结果阳性，则可判定样品具有增强细胞免疫作用
2.体液免疫功能
抗体生成细胞实验和血清溶血素测定如结果均为阳性，或其中一个实验的2个剂量组结果阳性，可判定具有增强体液免疫作用。
3.单核/巨噬细胞功能实验
小鼠碳廓清实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果均为阳性，或其中一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定具有增强非特异性免疫作用
4.NK细胞活性
一个以上剂量组结果阳性，可判定具有增强NK细胞活性作用
5.在1-4项实验中，若有2个功能检测呈阳性（其中1，2，3应在以上单项功
能判定的基础上），可判定该样品具有增强免疫作用。
6.对1-4任何一项实验，具有抑制作用，可判定该样品具有免疫抑制效应。
七、实验方法
1. 细胞免疫
小鼠脾淋巴细胞转化——MTT或放射性核素掺入法
DTH反应——耳肿胀法或足足石增厚法
2. 体液免疫
抗体生成细胞实验——Jerne改良玻片法）
血清溶血素实验——血凝法和半数溶血值HD50法测定
3. 非特异性免疫
小鼠碳廓清实验
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验——滴片法或半体内法
5.NK细胞活性
乳酸脱氢酶测定（LDH）法和放射性核素3H-TdR
八、法规要求将来可能增加的评价
1.血液学检查项目
细胞分化抗原分类检测
细胞分类计数指标
2.淋巴细胞转化增殖实验的改进
增加新方法：
5-溴脱氧尿苷掺入标记检测细胞增殖动力学指标
抗增殖细胞核抗原单抗或PCNA免疫组化染色
CFSE标记细胞检测细胞增殖能力
B淋巴细胞对有丝分裂原的反应性（LPS诱导）和混合淋巴细胞反应评价
3.单核/巨噬细胞吞噬功能实验
增加新方法：
单核/巨噬细胞计数
单核/巨噬细胞吞噬荧光微球的能力
单核/巨噬细胞吞噬FITC标记的细菌的功能
单核/巨噬细胞吞噬凋亡细胞的功能
单核/巨噬细胞呼吸爆发、趋化作用及细胞溶解活性，细胞因子释放活性
氧和活性氮等的定量检测。
4.NK细胞活性测定
增加新方法：
微细胞毒性方法
4h51Cr释放测定法。