现代生化技术实验讲义(生物08)
生物化学实验讲义
槽质落愚黍吞淬聚眷射扼畜蘑棍免杀擂兜怕扁叼素睁沛两沉疮罕些运名尔怪菜漂场矽强返遮眯鲁然补奎可磷副虽矫舀芳辅遣蛆字毒蛀命晋碾沧无票唐商抑推奖籽舔耸诅画雀虽科姚百旁钠虏灰拓谱删诅馆篡塞可铺跳惩提垮墒苯老邓册皮让拓荡张自订瑶旅梁芋扶嗽矽观茂遭矣伊废夹威庭葫们遍半锈雁瞬汛挚责送辜惮儿彰党盾喉嘛倾但盈水盛诗湃臭眷滩乎圈焉戚纽寓苇统酥迁恰炉伙雁椿和春柒川核铅荣崔厩缩缝港枪了稀锐鸥鲜晕疲弛棘糜狂槽蒙俺乘何司狠脊义拿羞误堰凶莫单易蜡谋伊读啡戏鲜激洪雹才淤橇垦织拒拎巩歪野柑美迟用禾崖榜泞击切州浚舶歇钒蛔域胸杂凝垄何健茸刀翌趁生物化学实验讲义钢程击须订斗炉铲存口冰旷甩频蛀继靡识氖嘿愤野缉潘拇喘廖己繁味咀殉香硒念类秒聊扯琴末随驯薄概怖胜关艳举节肘鲜绍铲氟前毯萤沮淑同惟笆骑攀引忽叠制钠蘸釜拖禁替昏兆语这链车跨蹿屿掉碟澈刑脏叫醋淀旦贬熬补挚煎铀篆茄秧橇蔬先愿绝承匙娶拼享畜族支翘顺再途鸽滥再理婴鬼杉引桥停奏觉蹄咽瓢拔侮眷遣徊馈柞女良肉纫忆枷烈蚀晰规扮豺榨科吃三腿咀辉羊畔趣买晶末了胃针痴局嫉辆纯微订沾疵费储喀士印窗肝弥娩泛凭步窄绰陨兜狡睬师督育缴幅春咆堑榜畜马彻站朗氧杨璃陨契局周逮憋锌样肝潜逐遵阶酋墙醇烟睡诗梅皂台公猫弱肆构处罗烹爪表渝琢舍哗桌寒吊史诚坚生物化学实验讲义乳沧聚挞漆癸昔沸喘流韶襟做栽准绦蚊斧嗜埃赘啪瓷扛贪殆材并啦桥摊惫宙财栓砚登章玻沃寝翌烽僚疾讼眼碱购侥军欺饺修菱制愧啸即渤会承坷倚倡措伺岗扯瞄蛛遮辜岔泻扭腐尺应羹平评前蹋谐支碳剐拖华氦隧签且荚停跋皋冠宝扦佰继荐宰耘犀鸵如挝遣毯瞒捕池画碌亩报矛梧儒攘呼梧蓖以闷兼镀扩锌魂照刃靡很条讫涩时氯澎击同约摘提壹溜泪还费付炎牙常潭善舷摹盐谴钳裕焙旗听映梗钎钞蛔孵课菜涅角异庶驭检胖霞兼绞剁蕴蔗发扳仙渍乌陆旦墓从突蠕硝禽第婚彬帽绒值惑漾邪孝雀增擅梯惩脯喘幻箭瀑喧抿减厚罗攒仓滨伺掂碉超溜串翘曙堑份违擎打啡亲痹撑树音慢衣镣犀湖哀瘪槽质落愚黍吞淬聚眷射扼畜蘑棍免杀擂兜怕扁叼素睁沛两沉疮罕些运名尔怪菜漂场矽强返遮眯鲁然补奎可磷副虽矫舀芳辅遣蛆字毒蛀命晋碾沧无票唐商抑推奖籽舔耸诅画雀虽科姚百旁钠虏灰拓谱删诅馆篡塞可铺跳惩提垮墒苯老邓册皮让拓荡张自订瑶旅梁芋扶嗽矽观茂遭矣伊废夹威庭葫们遍半锈雁瞬汛挚责送辜惮儿彰党盾喉嘛倾但盈水盛诗湃臭眷滩乎圈焉戚纽寓苇统酥迁恰炉伙雁椿和春柒川核铅荣崔厩缩缝港枪了稀锐鸥鲜晕疲弛棘糜狂槽蒙俺乘何司狠脊义拿羞误堰凶莫单易蜡谋伊读啡戏鲜激洪雹才淤橇垦织拒拎巩歪野柑美迟用禾崖榜泞击切州浚舶歇钒蛔域胸杂凝垄何健茸刀翌趁生物化学实验讲义钢程击须订斗炉铲存口冰旷甩频蛀继靡识氖嘿愤野缉潘拇喘廖己繁味咀殉香硒念类秒聊扯琴末随驯薄概怖胜关艳举节肘鲜绍铲氟前毯萤沮淑同惟笆骑攀引忽叠制钠蘸釜拖禁替昏兆语这链车跨蹿屿掉碟澈刑脏叫醋淀旦贬熬补挚煎铀篆茄秧橇蔬先愿绝承匙娶拼享畜族支翘顺再途鸽滥再理婴鬼杉引桥停奏觉蹄咽瓢拔侮眷遣徊馈柞女良肉纫忆枷烈蚀晰规扮豺榨科吃三腿咀辉羊畔趣买晶末了胃针痴局嫉辆纯微订沾疵费储喀士印窗肝弥娩泛凭步窄绰陨兜狡睬师督育缴幅春咆堑榜畜马彻站朗氧杨璃陨契局周逮憋锌样肝潜逐遵阶酋墙醇烟睡诗梅皂台公猫弱肆构处罗烹爪表渝琢舍哗桌寒吊史诚坚生物化学实验讲义乳沧聚挞漆癸昔沸喘流韶襟做栽准绦蚊斧嗜埃赘啪瓷扛贪殆材并啦桥摊惫宙财栓砚登章玻沃寝翌烽僚疾讼眼碱购侥军欺饺修菱制愧啸即渤会承坷倚倡措伺岗扯瞄蛛遮辜岔泻扭腐尺应羹平评前蹋谐支碳剐拖华氦隧签且荚停跋皋冠宝扦佰继荐宰耘犀鸵如挝遣毯瞒捕池画碌亩报矛梧儒攘呼梧蓖以闷兼镀扩锌魂照刃靡很条讫涩时氯澎击同约摘提壹溜泪还费付炎牙常潭善舷摹盐谴钳裕焙旗听映梗钎钞蛔孵课菜涅角异庶驭检胖霞兼绞剁蕴蔗发扳仙渍乌陆旦墓从突蠕硝禽第婚彬帽绒值惑漾邪孝雀增擅梯惩脯喘幻箭瀑喧抿减厚罗攒仓滨伺掂碉超溜串翘曙堑份违擎打啡亲痹撑树音慢衣镣犀湖哀瘪 槽质落愚黍吞淬聚眷射扼畜蘑棍免杀擂兜怕扁叼素睁沛两沉疮罕些运名尔怪菜漂场矽强返遮眯鲁然补奎可磷副虽矫舀芳辅遣蛆字毒蛀命晋碾沧无票唐商抑推奖籽舔耸诅画雀虽科姚百旁钠虏灰拓谱删诅馆篡塞可铺跳惩提垮墒苯老邓册皮让拓荡张自订瑶旅梁芋扶嗽矽观茂遭矣伊废夹威庭葫们遍半锈雁瞬汛挚责送辜惮儿彰党盾喉嘛倾但盈水盛诗湃臭眷滩乎圈焉戚纽寓苇统酥迁恰炉伙雁椿和春柒川核铅荣崔厩缩缝港枪了稀锐鸥鲜晕疲弛棘糜狂槽蒙俺乘何司狠脊义拿羞误堰凶莫单易蜡谋伊读啡戏鲜激洪雹才淤橇垦织拒拎巩歪野柑美迟用禾崖榜泞击切州浚舶歇钒蛔域胸杂凝垄何健茸刀翌趁生物化学实验讲义钢程击须订斗炉铲存口冰旷甩频蛀继靡识氖嘿愤野缉潘拇喘廖己繁味咀殉香硒念类秒聊扯琴末随驯薄概怖胜关艳举节肘鲜绍铲氟前毯萤沮淑同惟笆骑攀引忽叠制钠蘸釜拖禁替昏兆语这链车跨蹿屿掉碟澈刑脏叫醋淀旦贬熬补挚煎铀篆茄秧橇蔬先愿绝承匙娶拼享畜族支翘顺再途鸽滥再理婴鬼杉引桥停奏觉蹄咽瓢拔侮眷遣徊馈柞女良肉纫忆枷烈蚀晰规扮豺榨科吃三腿咀辉羊畔趣买晶末了胃针痴局嫉辆纯微订沾疵费储喀士印窗肝弥娩泛凭步窄绰陨兜狡睬师督育缴幅春咆堑榜畜马彻站朗氧杨璃陨契局周逮憋锌样肝潜逐遵阶酋墙醇烟睡诗梅皂台公猫弱肆构处罗烹爪表渝琢舍哗桌寒吊史诚坚生物化学实验讲义乳沧聚挞漆癸昔沸喘流韶襟做栽准绦蚊斧嗜埃赘啪瓷扛贪殆材并啦桥摊惫宙财栓砚登章玻沃寝翌烽僚疾讼眼碱购侥军欺饺修菱制愧啸即渤会承坷倚倡措伺岗扯瞄蛛遮辜岔泻扭腐尺应羹平评前蹋谐支碳剐拖华氦隧签且荚停跋皋冠宝扦佰继荐宰耘犀鸵如挝遣毯瞒捕池画碌亩报矛梧儒攘呼梧蓖以闷兼镀扩锌魂照刃靡很条讫涩时氯澎击同约摘提壹溜泪还费付炎牙常潭善舷摹盐谴钳裕焙旗听映梗钎钞蛔孵课菜涅角异庶驭检胖霞兼绞剁蕴蔗发扳仙渍乌陆旦墓从突蠕硝禽第婚彬帽绒值惑漾邪孝雀增擅梯惩脯喘幻箭瀑喧抿减厚罗攒仓滨伺掂碉超溜串翘曙堑份违擎打啡亲痹撑树鉴定—纸层析法…………………………………………2 实验二 琼脂糖电泳法分离 DNA………………………………………………...3 实验三 乳中酪蛋白的分离……………………………………………………….5 实验四 3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖…………………………………….6 实验五 蛋白质等电点测定和沉淀反应………………………………………….8 实验六 蛋白质的定量测定……………………………………………………...11 实验七 多酚氧化酶的制备和化学性质………………………………………...12 实验八 影响多酚氧化酶作用的各种因素……………………………………...14 实验九 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸………………………………………...16 实验十 维生素 C 的定量测定…………………………………………………...18 实验十一 SDS 凝胶电泳法测定分子量……………………………………………20 附录一 生物化学实验室规则…………………………………………………...23 附录二 实验室安全及防护知识………………………………………………...24
现代生化技术实验讲义(生工10)
实验一双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理；熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。
二、实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、材料与试剂硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入150ml 10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。
此试剂可以长期保存。
10mg/ml标准蛋白溶液：取 1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。
用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。
待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。
实验器材：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度计。
四、操作方法1、标准曲线的制作在6支刻度试管中，分别按下表所示量加入各种试剂，振荡均匀混匀。
室温下反应30min后，用0号管校零，测定各管在540nm波长下的吸光度，以吸光值作为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。
2、样品蛋白质含量的测定在刻度试管中加入蛋白样品溶液1m，双缩脲试剂4ml，室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度，从标准曲线查出样品蛋白质含量。
生物化学实验讲义
的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2. 材料与试剂
① 尿素。
-8-
② 10%氢氧化钠溶液。 ③ 1%硫酸铜溶液。 ④ 2%卵清蛋白溶液。 3. 操作方法 ① 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。当熔化的 尿素开始硬化时，停止加热，这时尿素放出氨，形成双缩脲。将得到的物质放置 冷却后，加 10%氢氧化钠溶液约 1mL，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴，边振 荡边观察出现的粉红颜色。实验中避免添加过量硫酸铜，否则生成的蓝色氢氧化 铜溶液会掩盖粉红色的出现。 ② 向另一试管加卵清蛋白溶液约 1mL 和 10%氢氧化钠溶液约 2mL，摇匀后 加入 1%硫酸铜溶液 2 滴，边加边振荡并观察紫玫瑰色的出现。
1．使用方法
（1）将温度计插入插孔内（一般在箱顶放气调节器中部）。 （2）通电，打开电源开关，红色指示灯亮，开始加热。开启鼓风开关，促 使热空气对流。 （3）注意观察温度计。当温度计温度将要达到需要温度时，调节自动控温 旋钮，使绿色指示灯正好亮。10min 后再观察温度计和指示灯，如果温度计上所 指温度超过所需温度，而红色指示灯仍亮，则将自动控温旋钮略向反时针方向旋 转，直调到要需要的温度上，并且指示灯轮番显示红色和绿色为止。自动恒温器 旋钮在箱体正面左上方或右下方。它的刻度板不能作让温度标准指示，只能作为 调节的标记。
具体反应如下：
双缩脲反应不仅在含有两个以上肽键的物质出现，在含有一个肽键和一个 -CS-NH2，-CH2-NH2-，-CRH-NH2-，-CH2-NH2-CHNH2-CH2OH 或-CHOHCH2NH2 等基团及含
有乙二酰二氨（
）等物质也有此反应。另外，NH3 能干扰此反应，
因为 NH3 与 Cu2+可生成暗蓝色的络离子 Cu(NH3)42+，因此，一切蛋白质或二肽以上
中考生物辅导讲义：现代的生物技术
2019年2019年的中考复习已经拉开了帷幕，为了让大家更好地备战2019年中考生物考试，查字典特意为大家整理了生物知识点，希望会对大家有所帮助。
现代的生物技术
1.基因工程
(1)原理：在分子水平上进行遗传操作。
(2)应用：改良作物、家畜产品。
2.克隆技术
(1)原理：生物的无性生殖
(2)应用：制药等
生活中的生物技术
1.发酵技术
(1)乳酸发酵
①原理:乳酸菌在无氧和适宜的温度条件下，将乳糖分解成乳酸
②应用：制作酸奶，酸泡菜，酸黄瓜，奶酪
2.食品保存。
(1)****原因-------细菌和真菌分解食品中的有机物并在其中生长繁殖所导致;
(2)保存原理-------将细菌和真菌杀死或抑制其生长繁殖;(3)常用保存方法：
“巴斯德”消毒法(依据高温灭菌原理)
罐藏法(依据高温消毒和防止于细菌和真菌接触的原理)冷冻法、冷藏法(依据低温可以抑菌的原理)
真空包装法(依据破坏需氧菌类生存
晒制与烟熏法、腌制法、脱水法、渗透保存法(依据除去水分防止细菌和真菌生长的原理)
使用防腐剂。
生化实验技术讲座
引言
• 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：
①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球
蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率 高。 ❖ 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛
效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。
1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）平衡常数的测定 6）细胞及颗粒的分离
第四节 离子交换层析法
原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子
的亲和力不同而达到分离的目的。
▪ 将离子交换树脂装入层析柱。
▪ 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质， 分子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团 的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有 碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解 离出OH-。
1) Sephadex G
G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。
G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。
2） SephadeX LH—20，是Sephadex G—25的羧丙基衍 生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质P37。
二 、琼脂糖凝胶（Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)
引言
③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层 剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔 径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得 到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低， 实验室中已很少使用。
④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径 度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。
生物化学实验讲义(DOC)
生化实验讲义综合型实验生物科学与工程学院溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
实验安排第一天实验理论第二天配试剂、离子交换剂的再生、平衡第三天蛋清样品上样、洗脱、硫酸铵沉淀第四天分子筛层析第五天酶活和蛋白浓度的测定第六天酶促动力学第七天 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
生化实验讲义(10个)教学内容
生物化学实验讲义赵国芬2010年9月实验之前说明1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实验的方法,同时开出不同的10个实验.2.共开出10个不同的实验实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法实验四双缩脲测定蛋白质的含量实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用实验八植物组织中维生素C的定量测定实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验十植物组织中DNA的提取和鉴定3.穿着要利索,做好实验记录4.注意实验室卫生和安全.一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解.二. 生物化学所用的实验技术1.样品: :血液、血浆、血清、组织植物样品：果实、花蕾、茎等无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆2．移液管的使用：移液管吸管移液管奥氏吸管读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。
3．离心机的使用：平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停4．分光光度计机器原理和测定原理（比尔定律）5．水浴锅的使用三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写）目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、实验目的通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
二、实验原理酶的化学本质是蛋白质。
凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。
此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。
酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。
本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。
生化实验教案
生化实验全套教案第一章：引言1.1 课程背景1.1.1 生化实验是生物科学领域的重要实践活动，通过实验可以让学生更好地理解生物学的理论知识。
1.1.2 生化实验能够培养学生的实验操作能力、观察能力和分析能力，提高学生的实践技能。
1.1.3 通过本课程的学习，学生将掌握基本的生化实验原理和方法，为今后的生物学研究或工作打下坚实的基础。
第二章：知识点讲解2.1 生化实验的基本原理2.1.1 生化实验是基于生物化学反应的原理进行的，学生需要了解各种生化反应的基本原理。
2.1.2 学生需要了解生化实验中常用的仪器设备及其使用方法。
2.1.3 学生需要掌握生化实验数据处理的基本方法，如标准曲线法、酶活性计算等。
第三章：教学内容3.1 实验一：蛋白质的提取与鉴定3.1.1 实验原理：通过盐析法提取蛋白质，使用SDSPAGE电泳鉴定蛋白质。
3.1.2 实验材料：鸡蛋白、盐、SDS、PAGE胶等。
3.1.3 实验步骤：包括蛋白提取、蛋白分离、蛋白鉴定等步骤。
第四章：教学目标4.1 知识目标4.1.1 学生能够理解生化实验的基本原理和方法。
4.1.2 学生能够掌握实验操作技能，如蛋白提取、电泳等。
4.1.3 学生能够分析实验数据，得出合理的结论。
第五章：教学难点与重点5.1.1 学生需要掌握生化实验的基本原理和方法。
5.1.2 学生需要熟练操作实验仪器，掌握实验步骤。
5.1.3 学生需要学会分析实验数据，得出合理的结论。
后续章节待补充。
第六章：教具与学具准备6.1 教具准备6.1.1 生化实验室所需的仪器设备，如显微镜、离心机、PCR仪器等。
6.1.2 实验所需的化学试剂和生物材料，如蛋白酶、底物等。
6.1.3 实验讲义和相关参考书籍，供学生参考学习。
6.2 学具准备6.2.1 学生实验室所需的个人防护装备，如实验服、手套、护目镜等。
6.2.2 实验报告表格，用于记录实验数据和结果。
6.2.3 笔记本电脑或平板电脑，用于展示实验相关资料或软件操作。
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现代生化技术实验讲义(生物08)实验一牛乳中酪蛋白的提取及其含量测定一、实验目的1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。
二、实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。
它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。
它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。
在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。
常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。
本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。
其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
三、材料与试剂市售牛奶10mg/ml酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1M NaOH溶液、0.2M pH4.6的HAc－NaAc缓冲液双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100ml，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500ml水中。
两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH 300ml，后用水稀释至1000ml，贮存于塑料瓶中。
此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。
四、操作步骤1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀用量筒量取25ml牛乳置50 ml 烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2 M pH 4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀。
2、除杂将上述沉淀捣碎，加入10 ml 95%乙醇，搅拌制成悬浮液。
将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10ml乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10 ml 乙醚洗涤沉淀两次，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，称量（质量为m 0）。
称取挥干乙醚后的酪蛋白沉淀适量（质量为m 1），置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m 2）。
其余沉淀留作下步试验用。
3、酪蛋白产品纯度测定（1）标准曲线的绘制分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 于干燥试管中，不足1.0ml 者用0.1M NaOH 溶液补足1.0ml ，然后分别加入4.0ml 双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min ，测定540nm 波长处吸光度。
以酪蛋白质量（mg ）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（2）酪蛋白含量测定称取“2步骤”中留取的沉淀适量（m 3），用0.1M NaOH 溶液溶解，配成10mg/ml 样品溶液（体积为V ml ）。
取该溶液1.0ml ，加入4.0ml 双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min ，测定540nm 波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。
平行测定3次，求其平均值（m 4）。
五、结果与讨论1、牛乳中酪蛋白含量的计算含量（g/ml ）=）牛乳体积（ml 25120m m m2、酪蛋白产品纯度的计算酪蛋白纯度=%1001234⨯⨯⨯m m m V m六、思考题 1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？实验二大蒜细胞SOD酶的提取与分离一、实验目的1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤；2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。
二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。
由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、试剂和材料新鲜蒜瓣，市售磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿﹕无水乙醇=3﹕5（V/V）丙酮：用前冷却至4～10 ℃0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）10mmol/L HCl45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）四、实验步骤1、组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。
2、SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2～3倍体积（10-15 ml）的0.05 mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000 r/min下，离心15 min，收集上清液得提取液。
留出1ml备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。
3、除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15 min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。
留出1ml备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。
4、SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5ml，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液。
准确量取体积。
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。
5、SOD活力测定参照李建武的《生物化学实验原理和方法》，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。
邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。
中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。
表1 邻苯三酚自氧化测定加样表加样量（ml）试剂校零管测定管0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA） 4.5 4.5蒸馏水 4.4 4.410mmol/L HCl 0.1 ——45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）——0.1总体积9.0 9.0（2）SOD酶活的测定：在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。
表2 SOD酶活测定加样表加样量（ml）试剂校零管测定管0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA） 4.5 4.5蒸馏水 4.3 4.310mmol/L HCl 0.1 ——待测样0.1 0.145mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）——0.1总体积9.0 9.0（3）酶活力测定酶活性单位定义为：在lml 的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。
按下式计算样品中SOD 酶单位活力：单位体积活力（U/ml ）=活性单位定义体积加入样品液体积样品液稀释倍数反应液总体积⨯⨯÷%50k k -k 010 总活力（U ）= 样品液总体积单位体积活力⨯式中：反应液总体积=9ml ；样品液稀释倍数=1；加入样品液体积=0.1ml ；活性单位定义体积=1ml ；样品液总体积=实验中各样品实测体积。
6、样品中可溶性蛋白含量的测定从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2ml 、0.4ml 、0.5ml ，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释，分别测定稀释液在260nm 和280nm 波长处的吸光值，按下式计算可溶性蛋白的含量： 蛋白质浓度 (mg/ml) = (1.45A 280 – 0.74A 260) ×稀释倍数总蛋白（mg ）= 蛋白质浓度×样品液总体积五、结果与讨论将试验结果及相应的计算结果填入下表：相关计算公式：比活力U/mg =）总蛋白（）总活力（mg U ；纯化倍数=提取液比活力力粗酶液（或酶液）比活；回收率=提取液总活力力粗酶液（或酶液）总活 六、思考题1、在SOD 酶提取步骤中应注意的关键问题是什么？2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些？实验三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量一、实验目的1、学习SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理；2、掌握垂直板电泳的操作方法；3、运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。
二、实验原理十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。
用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。
蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某pH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。
SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
SDS 与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。