核酸的制备
实验二细菌基因组DNA的提取
4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24： 1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提 两次）
DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
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核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
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DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
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RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
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四、注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
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核酸制备中常用的蛋白质变性剂
1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。
第二讲-核酸的制备1-2012
RNA: Base:
核酸分子具有游离5´磷酸的一端称为5 ´端，具有游离3 ´羟基的一端称为3 ´端。
A型DNA，为DNA双螺旋的一种形式，拥有与较普遍的B-DNA相似的右旋结构，
但其螺旋较短较紧密。
Z型DNA，是DNA双螺旋结构的一种形式，具有左旋型态的双股螺旋(与常见的
B-DNA相反)，并呈现锯齿形状。
然后合并上述两份杂交产物，加上新变性的Driver单链, 再次杂交, 产生 两端具有不同接头的cDNA 片段。 补齐cDNA 片段的粘性末端,利用根据接头序列设计的引物进行第一次 PCR 扩增, 这样只有含Adapter1和Adapter2R 的序列片断可以被扩增。
利用稀释后的第一次PCR 产物；加入根据接头长链序列设计的内侧引物 Nested1、 Nested2R 进行巢式PCR，进一步扩增具有差别表达的序列， 增强其特异性扩增。
成 cDNA, 然后用酶（Rsa I, oligo dT引物5‘端带有该酶切位点）切成大
小适合的具有平齐末端的 cDNA 片段。
把Tester平均分成两份, 再分别加上不同接头(Adapter1 和Adapter2R)，
通过与过量的Driver进行第一次杂交将双方的共同片段去除, 实现Tester 中差异片段的均等化，表达水平高时容易找到互补链。。
四碱基内切酶Dpn Ⅱ的一组接头，接头一侧形成该酶的粘性末端。 接头5´末端均被去磷酸化, 因而只有长片段( R -24、 J -24 和 N -24)能与Tester cDNA 酶切片段末端连接，并被作为接头专一性PCR 引物。
分别提取实验组( Tester ) 和对照组( Driver)的总RNA 或mRNA, 并反转录成 cDNA 双链。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
厦门大学基因工程课后思考题
第一章核酸的制备1.名词解释：脱氧核糖核酸：核糖核酸：ccc-DNA：当两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA（cccDNA）oc-DNA：如果两条核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA）l-DNA,：发生双链断裂而形成线性分子（L—DNA），L构型DNA变性：双联变成单链DNA复性：单链又变成双链PCR, 模板，引物2.分别阐述用CTAB裂解法，SDS裂解法，碘化钠裂解法以及蛋白酶K裂解法和溶菌酶裂解法裂解细胞的依据。
溶菌酶：破坏细胞的细胞壁肽聚糖骨架，在内部渗透压的作用下使得细胞胀破。
CTAB裂解法：CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚SDS裂解法：利用中性去污剂NP-40破坏全血的红细胞膜，离心弃去溶血液，收集白细胞沉淀，加入去污剂SDS以破坏白细胞核膜，并使核蛋白解离，再加入高浓度的NaCl使DNA溶解，同时使蛋白盐析。
通过离心收集水相，加2——2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA碘化钠裂解法：低渗破坏细胞，碘化钠破坏核膜蛋白酶K裂解法：蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解3.用于检测样品纯度和浓度的方法有哪些？简述个各方法的基本原理。
电泳、OD值、荧光定量法第二章基因工程工具酶1.名词解释：限制性内切核酸酶：在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA•裂口连接起来逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶DNA聚合酶：是一类催化DNA合成的酶类，酶的作用需要DNA或RNA作为模板，合成DNA链的序列与模板的序列互补Klenow片段（Klenow酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow 酶限制性图谱（物理图谱）：描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱，通常以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。
核酸提取方法三种
核酸提取方法三种核酸（DNA或RNA）的提取是生物学和分子生物学研究中的一项重要技术。
这些提取方法可分为化学法、机械法和磁珠法三种。
1. 化学法：化学法是最常用的核酸提取方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜和核膜，使得核酸被释放出来。
常用的化学试剂包括胰蛋白酶、SDS、EDTA、蛋白酶K等。
首先，组织样品需经过细胞破碎，方法可以是机械破碎或液氮冲击。
接下来，将样品中的蛋白质通过蛋白酶处理，以去除干扰。
然后，加入一定的试剂将DNA 或RNA稳定起来，并用氯仿醇萃取法或硅胶柱纯化法来分离核酸。
最后，用适当的缓冲液溶解核酸，使其适合后续实验使用。
2. 机械法：机械法适用于提取植物细胞原生质体中的DNA或RNA。
它的基本原理是通过物理力量破碎细胞壁和细胞膜，释放细胞质中的核酸。
机械法提取核酸的方法有刀切法、研磨法和玻璃珠破碎法等。
在刀切法中，样品被切成细小片段，然后用块状试剂研磨，最后用缓冲液洗净，使核酸溶解。
研磨法和玻璃珠破碎法则通过高速旋转或震荡的方法，利用玻璃珠等硬质物体对样品进行破碎。
3. 磁珠法：磁珠法是一种快速高效的核酸提取方法。
它利用表面修饰的磁性珠，通过磁场的作用来实现核酸的捕获、纯化和洗脱。
这种方法常用于自动化的核酸提取设备中，并通过磁力分离技术简化了传统柱层析法的操作步骤。
在磁珠法中，首先制备表面修饰的磁性珠，以使其能够选择性结合DNA或RNA。
然后，将样品与磁珠混合，使核酸与磁珠结合。
通过磁场的引导和离心沉降，磁珠与被结合的核酸被分离出来。
最后，通过洗脱步骤，将核酸从磁珠上解离，使其溶解在适当的缓冲液中。
总结：核酸提取是分子生物学研究中至关重要的一步，能够从组织样品中提取出纯度较高的DNA或RNA。
化学法、机械法和磁珠法是常用的核酸提取方法。
化学法利用试剂破坏细胞和核膜，使核酸被释放出来；机械法通过物理力量破碎细胞壁和细胞膜，释放细胞质中的核酸；磁珠法则利用表面修饰的磁性珠来捕获、纯化和洗脱核酸。
核酸的合成(RNA)
3
碱基的合成可由氨基酸经过多步生化反应生成， 也可从食物中摄取。
03 RNA的合成机制
转录过程
转录是RNA合成的关键过程， 它涉及以DNA为模板合成RNA
的过程。
在转录过程中，RNA聚合酶识 别DNA上的特定启动子序列，
并开始合成RNA链。
转录过程中，RNA聚合酶沿着 DNA模板移动，并添加与DNA 模板互补的核糖核苷酸到RNA 链上。
04
转录起始、延伸和终止
在延伸阶段，RNA聚合酶沿着DNA模板移动并 合成RNA链。
转录起始、延伸和终止过程中涉及一系列复杂的调控 机制，以确保RNA合成的准确性和效率。
转录起始是RNA合成的起始阶段，涉及RNA聚 合酶与DNA模板的结合。
转录终止是RNA合成的结束阶段，涉及RNA聚 合酶从DNA模板上释放并完成RNA链的合成。
RNA的合成是指通过一系列酶 促反应，将核苷酸聚合成为 RNA分子的过程。
RNA的合成过程
RNA的合成需要经过转录和翻译两个过程。
转录是指以DNA为模板，通过RNA聚合酶的作用，将核苷酸聚合成为RNA分子的过 程。
翻译是指以mRNA为模板，在核糖体上将氨基酸按照一定的顺序连接起来，形成蛋 白质的过程。
Байду номын сангаас4 RNA合成的调节
转录水平的调节
转录起始的调节
RNA聚合酶的启动子识别和结合是转录起始的关键步骤，可以通 过调控启动子的选择和使用来调节转录。
转录延伸的调节
转录过程中，RNA聚合酶的活性受到多种因素的调节，如磷酸化、 去磷酸化等，这些调控机制可以影响转录的速率和产量。
转录终止的调节
转录终止涉及RNA聚合酶到达终止子并释放RNA的过程，可以通 过调控终止子的选择和使用来调节转录。
核酸疫苗的制备工艺研究
核酸疫苗的制备工艺研究
核酸疫苗是一种新型的疫苗，其制备工艺包括以下主要步骤：
1. 选择适当的DNA或RNA质粒：核酸疫苗使用的DNA或RNA质粒必须具有目标抗原的基因序列，并且在质粒表达时能够产生目标抗原。
2. 质粒扩增：通过细菌发酵或其他方法，扩增目标DNA或RNA质粒。
3. DNA或RNA质粒纯化：通过离心、滤膜等方法将目标DNA或RNA质粒从细菌细胞中分离出来。
4. 质粒修饰：将质粒加入适当的启动子、信号序列、多聚尾等序列，以提高表达效率。
5. 表达载体构建：将修饰后的质粒插入表达载体中，形成重组表达载体。
6. 细胞培养：将重组表达载体转染到适当的细胞系中，进行培养。
7. 目标抗原表达：在细胞培养的过程中，目标抗原基因被表达，并且可以被细胞分泌或者表面展示。
8. 疫苗制备：根据需要将目标抗原从细胞中提取或者进行纯化，加入适当的辅
助物质进行疫苗制备和包装。
9. 疫苗质量检测：通过疫苗抗原性、疫苗纯度、细菌、真菌和病毒的检测，确保疫苗符合质量标准。
通过以上步骤，核酸疫苗可以得到高效、可靠的制备和生产。
核酸提取的原理及方法
核酸提取的常见方法及原理核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。
今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。
1、什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。
2、核酸提取类型1、总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。
2、miRNA提取MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。
他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
3、基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
4、质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
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四：沉淀核酸 1.将rnp部分用滴管吸出上层清液，在低 温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻 搅拌。低温放置15min，3000rpm离心 10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉 淀，待定性。 2.取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶 液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中 加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热 10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。
4.将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。
二：分离DNP、RNP
1.上层液倾出留待抽提RNA。 2.下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离 DNA核蛋白。
三： 沉淀核蛋白 1.上清液：0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋 白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带 塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混 悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。 2. 沉淀：将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以 3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入 带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的 异戊醇振摇30min，离心20min。
五：鉴定 1.RNA的呈色反应 取2支干净试管，一管加入1.5ml RNA溶液，另一管 加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂， 于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。 2. DNA的呈色反应 取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管 加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂， 于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反 应。
制作人：王世贵
制备方法：盐溶法
破碎细胞 鉴定
一：破碎细胞 1.将新鲜猪肝用0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬 酸）清洗干净。 2.用不锈钢刀片将猪肝切成小块。
3.把猪肝放入准备好的组织粉碎机，加入2倍体积的 0.14mol/LNaCl溶液（内 含 0.01mol/L柠檬酸）制备匀 浆。