核酸分子讲义杂交技术
核酸分子杂交课件
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
第4讲核酸分子杂交技术
第4讲核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(DNA/DNAorDNA/RNA)核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)主要内容第一节分子杂交技术的理论基础第二节核酸分子杂交的方法第三节核酸杂交的探针第一节分子杂交技术的理论基础核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院(CarnegieIntituteofWahington)的RoyBritten及其同事发明的关键步骤：变性—杂交(复性)--检测信号—结论变性复性DNA-DNA杂交双链分子信号的采集与处理结论一、DNA变性与复性(一)DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA 链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：1)热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。
2)酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。
3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂3、核酸溶液变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程)4、DNA变性曲线AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的变性DNA/总DNATm值：50%DNA分子发生变性的温度(即熔解曲线中点对应的温度),这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度(meltingtemperature,Tm)Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间的关系(G+C)%=(Tm-69.3)某2.44Tm=(G+C)%某0.41+69.3Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH值、离子强度和DNA的碱基比例DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/lNaCl溶液中较稳定(二)复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术是一种重要的生物学技术，它可以用来检测和分离DNA或RNA序列。
该技术基于两个互补的核酸序列之间的结合，通过杂交反应来检测目标序列的存在。
核酸分子杂交技术的原理是利用两个互补的核酸序列之间的结合来检测目标序列的存在。
这种结合是通过氢键和范德华力来实现的。
在杂交反应中，两个互补的核酸序列会结合在一起形成一个双链结构。
这个双链结构可以通过不同的方法来检测，例如放射性标记、荧光标记或酶标记等。
核酸分子杂交技术可以用来检测DNA或RNA序列。
在DNA杂交反应中，DNA序列会与互补的DNA序列结合。
在RNA杂交反应中，RNA序列会与互补的RNA序列结合。
这种技术可以用来检测DNA或RNA序列的存在，也可以用来分离DNA或RNA序列。
核酸分子杂交技术在生物学研究中有广泛的应用。
它可以用来检测病毒、细菌和真菌等微生物的存在，也可以用来检测基因突变和基因表达等生物学过程。
此外，核酸分子杂交技术还可以用来研究DNA或RNA序列的结构和功能。
核酸分子杂交技术是一种重要的生物学技术，它可以用来检测和分离DNA或RNA序列。
该技术的原理是利用两个互补的核酸序列之间的结合来检测目标序列的存在。
核酸分子杂交技术在生物学研究
中有广泛的应用，可以用来检测微生物的存在、研究基因突变和基因表达等生物学过程。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义核酸分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术手段。
它利用互补配对的原理，将两个核酸链在一定条件下结合成一个双链分子。
该技术可用于分析、检测、鉴定、筛选和修饰核酸分子等方面，具有重要的实验和临床应用价值。
一、技术原理核酸分子杂交技术的原理是基于核酸互补配对的规律。
核酸是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的双链分子，两条链通过氢键相互配对形成双螺旋结构。
在核酸分子杂交技术中，将两个互补的核酸链置于一定条件下（如适当的温度、pH值和离子浓度等），使它们形成双链分子。
这个过程中，两个链之间的氢键会断裂，然后重新组合成新的氢键，形成一个更稳定的双链分子。
这个过程被称为“杂交”。
二、应用领域1. 分析基因序列核酸分子杂交技术可用于分析基因序列。
通过与已知序列相比较，可确定未知序列的位置和组成。
这种技术被广泛应用于基因组学和生物技术领域，包括基因定位、基因诊断、基因克隆和基因表达研究等方面。
2. 检测病原体核酸分子杂交技术可用于检测病原体。
该技术可以检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的存在和数量。
与传统的细菌培养方法相比，核酸分子杂交技术具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速和准确地诊断疾病。
3. 鉴定基因型核酸分子杂交技术可用于鉴定基因型。
通过检测DNA序列的变异，可以确定不同基因型之间的差异。
这种技术被广泛应用于疾病的遗传咨询、人类学研究和法医学等领域。
4. 筛选基因库核酸分子杂交技术可用于筛选基因库。
该技术可以通过与探针的杂交来筛选目标基因，从而快速地鉴定和克隆感兴趣的基因。
这种技术被广泛应用于基因工程、药物研发和生物产业等领域。
5. 修饰核酸分子核酸分子杂交技术可用于修饰核酸分子。
通过与修饰剂的杂交，可以将不同的化合物引入到核酸分子中，从而实现对分子结构和性质的调控。
这种技术被广泛应用于药物研发、生物材料和生物传感器等领域。
三、实验步骤核酸分子杂交技术的实验步骤包括样品处理、杂交反应、检测和数据分析等环节。
核酸分子杂交概念解释
核酸分子杂交概念解释
核酸分子杂交是指两条核酸链（通常是DNA或RNA链）通过互相结合，形成一个稳定的双螺旋结构的过程。
这种结合是通过碱基间的氢键形成的，碱基之间的配对是高度选择性的。
DNA分子的碱基配对规则是腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键。
核酸分子杂交在生物学和分子生物学中有许多应用，其中最为著名的是分子杂交技术（molecular hybridization technique）。
这一技术可用于检测和分析DNA或RNA 的序列相似性，以及研究基因表达、基因组结构等方面。
以下是核酸分子杂交的一些关键概念：
1. 碱基配对：核酸分子的稳定性来自于两条链之间的碱基配对。
在DNA中，A与T 形成两个氢键，G与C形成三个氢键。
RNA中的规则类似，但是T被替换为尿嘧啶（U）。
2. 选择性：核酸分子杂交的过程是高度选择性的，只有符合碱基配对规则的两条链能够结合。
这种选择性是生物体内DNA复制和RNA转录的基础。
3. 热力学稳定性：杂交的稳定性受到环境条件的影响，尤其是温度。
高温通常会导致核酸分子的解离，而低温则有助于形成更稳定的双链结构。
4. 杂交实验：分子生物学中的分子杂交实验利用了核酸分子的互补配对性质。
例如，通过将待测的DNA或RNA与已知序列的标记分子杂交，可以用于检测目标序列的存在、测定相对丰度等。
5. 应用领域：核酸分子杂交技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等方面有广泛应用，为研究生物学和遗传学提供了重要工具。
核酸分子杂交技术
（二）固相分子杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支 持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进 行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上， 故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的 游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被 检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛 应用。
1、菌落杂交
用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。 主要步骤： 菌落平板培养 滤膜灭菌后放到细菌平板上 菌落粘到滤膜上 滤膜放到杂交液中 探针杂交 检测
影印滤膜转移
2、从凝胶上转移DNA • （1）毛细转移（虹吸原理） • （2）真空转移 • （3）电转移
（三）核酸的固定
• 1、烘烤 80℃2小时
• 2、紫外光固定
• 3、碱固定
（四）杂交 • 1、预杂交 （1）目的：减少非特异性杂交 （2）预杂交液的主要成分：
12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4 125mL 20×SSC 25mL 100×Danhardt’s液 5mL 5mg/mL鲑鱼精DNA 250mL 100%去离子甲酰胺 加H2O 至500mL-20℃贮存 封闭剂：Denhard氏溶液，鲑鱼精DNA,小牛胸腺 DNA, 脱脂奶粉。
④安全、无环境污染；
2.标记物的种类
（1） 放射性标记物（同位素）：
32P、35S、3H、125I等
（2） 非放射性标记物： 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生 物素（biotin）、荧光素。 两者比较：后者不及前者敏感，但后者 保存时间较长，无同位素污染。
3、标记方法
（1）随机引物法（random priming） 将6-8个碱基的寡核苷酸片段（随机引物） 与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段 随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA 聚合酶I Klenow片段作用下，以标记的dNTP 为原料，以寡核苷酸为引物沿5’至3’方向，合 成一条与模板互补的新DNA链。