分子荧光法

除了吸收光能使分子受激发而发光，根据 起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的 发光类型（例如：生物发光、热发光、化学 发光和摩擦发光）区别开来。

通过化学反应使分子受激而发光称为“化 学发光”。利用化学发光进行分析工作叫 “化学发光分析”。

化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称 为“分子发光分析（molecular luminescence）”。
第三章
Hale Waihona Puke 荧光分光光度法( Fluorescence Spectrophotometry )
前言：

1852年，斯托克斯（Stokes）发现了萤石 在暗处受到光的照射时，会发出一种蓝白 色的光，他把这种光命名为“萤光”。 1868年 ，Goppelstroeder 发表了利用Al-桑 色素的绿色荧光来分析微量Al的分析方法， 可见荧光分析法是一种历史悠久的分析方 法。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
•
位置 • 邻、对位取代，荧光增强；

•
间位取代，荧光减弱。
分子所处的环境 如：溶剂、温度、pH等都可能会影响 分子的结构或立体构象，当然也就会影响 分子能否产生荧光。

（2）无机化合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧 光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。 但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
根据光的吸收定律，得：I=I0×10-cl 则： I a =I0-I=I0-I0×10-cl= I0(1- e-2.303cl) ……（3-1）
因为溶液的荧光发射强度F和它吸收的光 能I a成正比，并且与荧光物质的荧光效率有关。 所以： F= I a= I0(1-e-2.303cl) (3-2) 式中： 为荧光效率，而其中e-2.303cl展开得
a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
b. 发射光谱：选择并固定激发波长EX和狭 缝宽度S，让发射单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随发射波长的变化而变化 的关系曲线，叫发射光谱。
磷光与荧光的区别主要为： (1) 产生磷光的过程稍长，约在10-5~0.1 秒， 有时长达1 秒以上； (2) 在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍 能检测到磷光；而上述荧光现象在照射光一 旦停止照射，荧光便立即消失。
3. 迟滞荧光（延迟荧光） 某些分子在跃迁至三重线态之后，通过 热激活作用，可以再回升至第一电子激发态 的各振动能级上，然后再由第一电子激发态 的最低振动能级（v=0）降落至基态的各个不 同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧 光（或延迟荧光）。
（3）荧光总量 荧光发射谱的面积积分，称为荧光总量。
（4）峰值波长和谱带宽度 a. 峰值波长—在谱图（包括：激发谱和发射 谱）中具有最大荧光强度所对应的波长， 称为峰值波长。
b. 谱带宽度—常用“半宽”来表示，即荧光 峰强度值的一半时所对应的波长宽度。
或：荧光谱的半高宽称为谱带宽度。
（5）量子产率（或称：荧光效率）
（7）荧光寿命 它是研究分子结构时要求的参数。 定义：荧光强度衰减到1/e所需的时间， 用表示。
任意时间（t）的荧光强度 If =If0e-t/=If0e-kt
式中：If —移去激发光源后任一时间t时 的荧光强度； If0—激发时最大的荧光强度； k —仪器衰减常数； —激发态的平均寿命。
４. 分子吸收光谱与分子荧光光谱的关系 分子吸收光谱和分子荧光光谱都是分子 内部振动能级结构的反映，但是分子吸收光 谱是反映电子激发态中各个振动能级结构情 况。 在大多数分子中，由于电子激发态和电 子基态的各个振动能级结构相似，因此吸收 光谱和荧光光谱往往呈现大致的镜像对称关 系。
3.2 荧光与物质分子结构之间的关系 １. 物质产生荧光的两个必须条件 （1）物质分子必须具有能吸收一定频率光 的特征结构； （2）物质分子在吸收了特征频率的辐射能 之后，必须具有高的荧光率，即具有较高的 荧光效率（fluorescence efficiency）。 荧光效率(又称：量子产率，记为) = 发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
在定性分析时，一般是在一定实验条件 下，用荧光分光光度计作试样和标样的激发 光谱和荧光光谱，然后比较它们的光谱图， 即可鉴定试样物质。 有时需改变溶剂后再比较它们的光谱 图，如二者一致，即为同一物质。
（2）定量方法 目前，荧光分析多数用于荧光物质的定 量分析。常用的定量方法有直接比较法、工 作曲线法和内标法。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
（8）荧光分析的灵敏度 —对整个发射光谱而言； /H —对部分发射光谱而言，即对所 测到的不是整个荧光光谱，只是靠近荧光 峰的一个狭窄的谱带（H：为荧光峰的半 高宽/谱带宽度）。
2. 荧光分析方法 （1）定性方法 不同分子结构的各种荧光物质，具有不 同的激发光谱（即：吸收光谱）和荧光光谱， 这是分子荧光分析的定性依据。
=发出的光量子数/吸收的光量子数
（6）荧光偏振 在研究分子的结构变化时用。用来研究 荧光的各向异性（荧光的偏振性）。它是在 激发和发射光路中引入两个偏正器。它可用 偏振度（P）表示： P=（FII -F）/（FII +F）
式中：FII表示与激发光振动方向平行振 动的偏光成分；F表示与激发光振动方向垂 直振动的偏光成分。
e-2.303cl=1-2.303cl+(-2.303cl)2/2!+ (-2.303cl)3/3!+…
(3-3)
若溶液浓度c很低， 、l都是定值，则cl 的值很小，当A=cl<0.05时，上面级数展开 式中第二项以后的各项可以忽略不计，因此：

e -cl = 1-2.303cl （3-4） 将（3-4）代入（3-2）得 ： F= 2.303 I0cl （3-5） 当入射光强度I0一定时， F= Kc （3-6）
a. 直接比较法 设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为 FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或 Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
注意：上述记录的激发和发射光谱均为 “表观光谱”。 它受仪器的光源特性、单色器的特性 和检测器的特性等因素影响。
对于同一个试样，用不同的荧光仪记录 的“表观光谱”需进行校正；经过校正的光 谱称为“真实荧光光谱”又叫“校正光谱”。 现代化的仪器都具有自动记录校正光谱 的功能。
（2）荧光强度 荧光物质吸收辐射能后才会发射荧光， 因此，溶液的荧光强度和该溶液的吸光程度 以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。 设I0和I分别为照射在待测溶液上的入射 光和透过光强度，c和l分别为待测溶液浓度 和液层厚度，则被测溶液吸收的光强度为： I a= I 0-I
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
荧光效率愈大，荧光的发射强度愈大， 无辐射跃迁的几率就愈小。 当荧光效率等于零时就意味着不能发射 荧光。因此，荧光物质必须具有较大的荧光 效率。
２. 物质产生荧光与其分子结构的关系 （1）有机化合物的结构与分子荧光的关系 a. 碳原子骨架 一般含有共扼体系的分子可产生荧光。 共扼度越大，则离域电子愈易被激发，愈 易产生荧光。 所以绝大多数荧光物质含有芳香环或杂 环。

时至今日，荧光分析在方法上取得了极 大的进展。 促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光 偏振、荧光免疫和同步荧光等荧光分析新方 法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析 仪器的出现。
在仪器方面，微机控制的全自动荧光分 析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法 高2 - 3个数量级）、选择性好、工作曲线线 性范围宽且能提供激发光谱、发射光谱、发 光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向 异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕 量分析技术。
需要注意的是： （1）整个过程是在单线态之间进行的；

（2）产生荧光的过程极快，约在10-8 秒左 右 内完成； （3）荧光的产生是从第一电子激发态的最 低振动能级开始，而与荧光物质分子被激发 至哪一个能级无关。 因此，荧光光谱的形状和激发光的波长 无关。
2. 磷光（Phosphorescence） 当某些物质分子被激发到较高的能级， 并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的 最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至 基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个 中间的亚稳态能级—三重线态上，这些分子 在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态 的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光， 称这种发出的辐射光为磷光。