分析细菌的产酶能力
不同来源纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶能力的比较
第32卷第4期V o l.32N o.4草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年4月A p r.2024d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2024.04.030引用格式:陈欢,史子浩,吴春会,等.不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较[J].草地学报,2024,32(4): 1252-1258C H E N H u a n,S H I Z i-h a o,WU C h u n-h u i,e t a l.S c r e e n i n g,I d e n t i f i c a t i o na n dC o m p a r i s o no fE n z y m eP r o d u c t i o nC a-p a c i t y o fC e l l u l o s e-D e g r a d i n g B a c t e r i a f r o m D i f f e r e n t S o u r c e s[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2024,32(4):1252-1258不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较陈欢1,史子浩1,吴春会1,李秋凤1,于晓梦1,徐领1,贾海阔1,刘震灵1,王明亚1,2* (1.河北农业大学动物科技学院,河北保定071000;2.农业农村部奶牛健康养殖重点实验室(部省共建),河北保定071000)摘要:为了选育纤维素高效降解菌,提高纤维素降解效率㊂本研究从肉牛瘤胃液㊁肉牛粪便,蝗虫肠道末筛选纤维素降解能力较强的株系,对其进行生物学鉴定和酶活性比较㊂结果表明,从肉牛瘤胃液中筛选出纤维素降解株系L7,L8-1和L9,分别鉴定为高地芽孢杆菌(B a c i l l u s a l t i t u d i n i s)㊁暹罗芽孢杆菌(B.s i a m e n s i s)和枯草芽孢杆菌(B.s u b t i l l u s);从蝗虫肠道末中筛选得到株系H2-1和H3-1,分别鉴定为枯草芽孢杆菌(B.s u b t i l l u s)和解蛋白芽孢杆菌(B.p r o t e o l y t i c u s);从肉牛粪便中筛选得到株系F8-2被鉴定为高地芽孢杆菌(B.a l t i t u d i n i s)㊂其中降解能力最强的株系为L7,其全酶(F P A)㊁外切葡聚糖酶(C1),内切葡聚糖酶(C M C)和β-葡萄糖苷酶(β-G a s e)活性分别为4.28,1.89,5.57,2.30U㊃m L-1㊂菌落D/d平均值与F P A,C M C,C1,β-G a s e的酶活性呈显著正相关(P<0.05)㊂本研究筛选得到株系L7具有较强的纤维素降解能力,为提高饲料转化率提供了更多可能㊂关键词:纤维素降解菌;酶活性;芽孢杆菌中图分类号:S816.3文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)04-1252-09S c r e e n i n g,I d e n t i f i c a t i o na n dC o m p a r i s o no fE n z y m eP r o d u c t i o nC a p a c i t y o fC e l l u l o s e-D e g r a d i n g B a c t e r i a f r o m D i f f e r e n t S o u r c e sC H E N H u a n1,S H I Z i-h a o1,WU C h u n-h u i1,L IQ i u-f e n g1,Y U X i a o-m e n g1,X U L i n g1,J I A H a i-k u o1,L I UZ h e n-l i n g1,WA N G M i n g-y a1,2*(1.C o l l e g e o f a n i m a l s c i e n c e a n d t e c h n o l o g y,H e b e iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,B a o d i n g,H e b e i P r o v i n c e071000,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o fH e a l t h y B r e e d i n g i nD a i r y C a t t l e(C o-C o n s t r u c t i o nb y M i n i s t r y a n dP r o v i n c e),B a o d i n g,H e b e i P r o v i n c e071000,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t o s c r e e na n d c u l t i v a t e e f f i c i e n t c e l l u l o s ed e g r a d i n g s t r a i n s a n d i m p r o v e t h e e f f i c i e n c y o f c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n,i n t h i s s t u d y,w e s c r e e n e d t h e s t r a i n sw i t hs t r o n g c e l l u l o s ed e g r a d a t i o na b i l i t y f r o m r u m e n f l u i d,f r e s he x c r e t ao fb e e f c a t t l e,a n d l o c u s th i n d g u t,p e r f o r m e db i o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n,a n dc o m-p a r e d t h e i r e n z y m e-p r o d u c i n g a c t i v i t y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e c e l l u l o s e-d e g r a d i n g b a c t e r i a s t r a i n s L7, L8-1,a n dL9w e r e s c r e e n e d f r o mt h e r u m e n f l u i d o f S i m m e n t a l c a t t l e a n d i d e n t i f i e d a sB a c i l l u s a l t i t u d i n i s, B.s i a m e n s i s a n dB.s u b t i l l u s,r e s p e c t i v e l y.T h e s t r a i n sH2-1a n dH3-1w e r e s c r e e n e d f r o ml o c u s t h i n d g u t a n d i d e n t i f i e d a s B.s u b t i l l u s a n d B.p r o t e o l y t i c u s,r e s p e c t i v e l y,a n d t h e s t r a i nF8-2f r o mc a t t l e e x c r e t aw a s i d e n t i f i e da s B.a l t i t u d i n i s.T h es t r a i nL7s h o w e dt h es t r o n g e s td e g r a d a t i o na b i l i t y,e n z y m ea c t i v i t y o f w h i c h i nF P A,C M C,C1,a n dβ-G a s ew a s4.28,1.89,5.57,a n d2.30U㊃m L-1,r e s p e c t i v e l y.C o r r e l a t i o na-n a l y s i s s h o w e d t h a t t h eD/d v a l u e s o f c o l o n y w e r e s i g n i f i c a n t l y p o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t h e n z y m e a c t i v i t y o f F P A,C M C,C1,a n dβ-G a s e(P<0.05).I n t h i s s t u d y,t h e s t r a i nL7s h o w e ds t r o n g e r c e l l u l o s ed e g r a d a t i o n a b i l i t y t h a no t h e r s t r a i n s,a n d p r o v i d e dm o r e p o s s i b i l i t i e s t o i m p r o v e t h e f e e d c o n v e r s i o n r a t e o f c r u d e f i b e r u t i l i z a t i o n.K e y w o r d s:C e l l u l o s e-d e g r a d i n g b a c t e r i a;E n z y m a t i c a c t i v i t y;B a c i l l u s收稿日期:2023-12-18;修回日期:2024-01-28基金项目:河北农业大学引进人才科研专项(Y J201826);河北省现代农业产业技术体系建设专项资金(H B C T2023160205)资助作者简介:陈欢(1999-),男,满族,河北承德人,硕士研究生,主要从事动物营养与饲料科学研究,E-m a i l:177********@163.c o m;*A u-t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:h e b e i g r a s s@163.c o m第4期陈欢等:不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较纤维素是牧草和农作物秸秆的主要成分,约占总干重的30%~50%[1],是自然界中最丰富的反刍动物饲料资源,将牧草和农作物秸秆调制成青贮饲料过程中,充分降解和利用其中的粗纤维素是畜牧业降本增效的有效措施㊂目前许多研究通过添加外源纤维素酶,来降解和充分利用纤维素,达到改善青贮饲料发酵品质的目的[2]㊂然而由于酶制剂成本高㊁性能不稳定及p H值适应范围较窄等因素,限制了其在青贮饲料中的广泛应用[3-4]㊂纤维素降解菌具有成本低,适应性广等优点,可降解植物中的结构性纤维素,并将其转化为单糖进而被乳酸菌和家畜利用,因此,筛选并获得能高效降解牧草和农作物秸秆中的粗纤维的纤维素降解菌是畜牧业降本增效的重要因素㊂纤维素降解细菌相比于真菌具有结构简单㊁繁殖周期短㊁抗逆性强㊁耐酸㊁产酶活性高等特点而成为研究热点[5]㊂虽然,近年来对纤维素降解菌的研究比较多,但大部分纤维素降解菌都不同程度地存在酶系不完全㊁活性不高㊁酶作用条件苛刻等问题,需要进一步去挖掘纤维素降解菌资源㊂且来源为土壤㊁废纸浆㊁温泉等的纤维素降解菌安全性存在问题[6-8],不便直接运用于畜牧业中的饲料加工及饲喂㊂有研究人员从腐质土㊁朽木和土样中筛选出了纤维素降解细菌,有的对秸秆有显著降解作用[9]㊂动物类来源纤维素降解菌如瘤胃微生物和蝗虫肠道末微生物等具有更安全的特性,且种类繁多㊁数量巨大,仍存在大量的纤维素降解菌资源未被开发㊂虽然对动物类来源纤维素降解菌也有一定的研究,但是,对不同来源的纤维素降解菌酶活性进行比较的研究很少[10]㊂因此,本研究从肉牛瘤胃液,肉牛粪便,蝗虫肠道末,筛选纤维素降解能力较强的株系,对其进行生物学鉴定和产酶活性进行比较,筛选产酶能力佳的株系,为高效纤维素降解株系筛选提供借鉴㊂1材料与方法1.1试验材料西门塔尔牛瘤胃液㊁粪便样品采集于保定市定兴县燕园肉牛有限公司,东亚飞蝗购买于山东省临沂市费县富裕蚂蚱养殖基地㊂称取肉牛瘤胃液1m L㊁粪便10g,蝗虫肠道末内容物分别放入装有100m L无菌水的锥形瓶中,37ħ振动20m i n,制得悬浮液㊂本研究所用培养基配制如下:牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g㊃L-1㊁蛋白胨10g㊃L-1㊁N a C l5g㊃L-1,p H值7.0㊂羧甲基纤维素钠液体培养基:C M C-N a10g㊃L-1, K2H P O41g㊃L-1,N H4N O31.0g㊃L-1,C a C l20.02 g㊃L-1,M g S O4㊃7H2O0.2g㊃L-1,F e C l3㊃6H2O 0.05g㊃L-1,p H7.0,固体培养基加琼脂15 g㊃L-1㊂赫奇逊液体培养基:磷酸二氢钾1.0g㊃L-1㊁七水硫酸镁0.3g㊃L-1㊁氯化钠0.1g㊃L-1㊁硝酸钠2.5g㊃L-1㊁氯化铁0.01g㊃L-1,氯化钙0.1 g㊃L-1㊂刚果红染色液:称取0.1g刚果红溶于100m L 蒸馏水中㊂氯化钠溶液:称取5.85g氯化钠溶于100m L 蒸馏水中㊂产酶培养基:(N H4)2S O42.0g㊃L-1,K H2P O4 3.0g㊃L-1,C o C l23.0g㊃L-1,F e S O47.5g㊃L-1, M n S O4㊃H2O2.5g㊃L-1,Z n S O4㊃7H2O2.0 g㊃L-1,M n S O4㊃7H2O0.5g㊃L-1,C a C l20.5g㊃L-1㊂葡萄糖标准溶液:将10g葡萄糖烘干至恒重,用1%C M C-N a的0.05m L盐缓冲液溶解并定容至100m L,4ħ保存㊂羧甲基纤维素钠(C M C-N a)㊁3,5-二硝基水杨酸(D N S)㊁无淀粉滤纸㊁脱脂棉㊁水杨苷等购自北京索莱宝科技有限公司㊂1.2试验方法1.2.1富集培养在超净工作台中,吸取1m L菌悬液,将其添加至500m L的牛肉膏蛋白胨的液体培养基中,于37ħ,150r㊃m i n-1的摇床(H Z Q-X100,常州金坛精达仪器制造有限公司)上进行24 h的培养㊂1.2.2纤维素降解菌的分离与纯化将培养的菌液做标准液按十倍级数稀释,各吸取稀释倍数为10-5,10-6,10-7倍的菌液50μL涂于羧甲基纤维素钠固体培养基上,按各稀释倍数进行3次重复㊂于37ħ条件下进行24h的细菌培养㊂1.2.3纤维素降解菌的筛选将纯化的株系通过接种环分离出单个菌落,放置在羧甲基纤维素固体平板上,置于37ħ的恒温培养箱(L C-G Z X-150T,上海力辰邦西仪器科技有限公司)中,进行2d的倒置培养㊂在细菌生长2d后,用1g㊃L-1刚果红染色30m i n,然后用1m o l㊃L-1N a C l溶液对其进行脱色3521草地学报第32卷30m i n[11]㊂当出现一个清晰的透明圈,测量透明圈直径(D)与菌落直径(d),计算D/d值并选择平均值比较大的株系㊂1.2.4滤纸降解试验将所获得株系置于赫齐逊液体培养基中,在37ħ,150r㊃m i n-1下培养10d;每组3个平行,根据滤纸的崩解情况判断株系降解纤维素的能力㊂1.2.5标准曲线的绘制取8支20m L刻度的试管,分别加入1m g㊃m L-1的葡萄糖标准溶液0,0.2, 0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4m L,补加蒸馏水至总体积为2m L,配制成浓度梯度的葡萄糖溶液㊂向各试管中加入2m L D N S溶液,摇匀后沸水浴5m i n,立即取出冷却,用蒸馏水定容至20m L㊂在波长540n m下,以未加入葡萄糖标准溶液的试管作为对照调零点,测定其它各管溶液的光密度(O p t i c a l d e n s i t y,O D)值并记录结果㊂以葡萄糖含量(m g)为横坐标,以对应的O D值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线㊂1.2.6酶活性测定取筛选出的菌悬液以1%接种量接种于产酶培养基中,37ħ,150r㊃m i n-1培养4d,发酵液6000r㊃m i n-1离心10m i n后取上清液作为粗酶液㊂粗酶液与无淀粉滤纸(W h a t m a n)㊁脱脂棉㊁羧甲基纤维素钠(C M C-N a)和水杨苷四种底物反应的产物与3,5-二硝基水杨酸(D N S)溶液发生氧化还原反应,在波长540n m下比色测定还原糖量,根据线性关系测定F P A,C M C,C1和β-G a s e 的酶活性[12],酶活性单位为U㊃m L-1,定义1m L 酶液每分钟催化底物水解生成1μg葡萄糖所需要的酶量为1个纤维素酶活性单位(U)㊂1.2.7分子生物学鉴定提取菌液D N A,以通用引物27F(5'-A G A G T T T G A T C MT G G C T C A G-3')和1492R(5'-T A C G G Y T A C C T G T T A C G A C T T-3')进行P C R扩增,扩增体系为25μL,包括:上游引物(10μm o l㊃L-1)1μL,下游引物(10μm o l㊃L-1) 1μL,D N A模板(稀释20倍)1μL,d d H2O22μL㊂P C R反应程序为:95ħ预变性1m i n;95ħ30s;53ħ30s;72ħ30s;35次循环,最后72ħ延伸7m i n㊂将P C R扩增产物进行电泳检测,回收的P C R产物送至北京志超伟业生物技术有限公司进行16s r R N A 测序,序列通过N C B I(w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v)中的B L A S T进行同源性分析㊂1.2.8数据统计与分析利用E x c e l2019进行数据录入整理,用S P S SS t a t i s t i c s23.0(I B M,N Y, U S A)进行单因素方差分析,用D u n c a n多重比较检验法对数据进行多重比较(P<0.05),用G r a p h P a d P r i s m9.5(G r a p h P a dS o f t w a r e,C A,U S A)对试验数据进行图表绘制,结果用平均数ʃ标准差表示㊂2结果与分析2.1纤维素降解菌的分离与筛选通过对肉牛瘤胃液㊁粪便㊁蝗虫肠道末内容物的富集培养㊁稀释涂布,划线分离一共得到15个株系,经刚果红培养基鉴定后,有6个株系产纤维素酶,部分株系的刚果红染色结果(图1)㊁透明圈与株系直径大小表明(表1),15个株系的D/d平均值为1.42~6.14,其中L7,L8-1,L9,H3-1,H2-1,F8-2的D/d平均值分别为6.14,5.29,4.54, 2.17,2.14和4.49,对这6个D/d值较大的株系进行酶活性测定㊂图1株系L7的刚果红染色F i g.1 T h e s t r a i nL7s t a i n e dw i t hC o n g o r e dd y e4521第4期陈 欢等:不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较表1 分离出的15个纤维素降解菌株系透明圈直径、菌落直径和滤纸崩解结果T a b l e 1 T r a n s p a r e n c y c i r c l e d i a m e t e r ,c o l o n y d i a m e t e r a n d f i l t e r p a p e r d i s i n t e gr a t i o n r e s u l t s o f 15i s o l a t e d c e l l u l o s e -d e g r a d i n g ba c t e r i a l s t r a i n l i n e s 株系编号S t r a i nN o .透明圈直径(D )T r a n s pa r e n t c i r c l e d i a m e t e r /c m 菌落直径(d)C o l o n y di a m e t e r /c m D /d滤纸崩解F i l t e r s t r i p d e gr a d a t i o n 株系来源S t r a i n s o u r c eL 8-14.67ʃ0.640.88ʃ0.075.29ʃ0.34b+++瘤胃液L 73.16ʃ0.400.52ʃ0.086.14ʃ0.12a++++瘤胃液L 91.80ʃ0.200.40ʃ0.094.54ʃ0.94c+++瘤胃液L 81.28ʃ0.100.51ʃ0.062.53ʃ0.31de++瘤胃液H 110.58ʃ0.230.32ʃ0.081.80ʃ0.29e f+蝗虫肠道末H 2-10.50ʃ0.100.23ʃ0.062.17ʃ0.29e f++蝗虫肠道末H 140.77ʃ0.060.43ʃ0.081.80ʃ0.20ef+蝗虫肠道末H 150.52ʃ0.100.27ʃ0.061.94ʃ0.10e f++蝗虫肠道末H 3-10.57ʃ0.100.27ʃ0.062.14ʃ0.13e f++蝗虫肠道末F 40.97ʃ0.250.70ʃ0.311.46ʃ0.24f+肉牛粪便F 10.60ʃ0.040.41ʃ0.051.47ʃ0.12f++肉牛粪便F 20.40ʃ0.010.28ʃ0.031.42ʃ0.16f+肉牛粪便F 30.60ʃ0.020.38ʃ0.051.60ʃ019f++肉牛粪便F 8-21.63ʃ0.150.42ʃ0.194.49ʃ0.10c+++肉牛粪便注:数据为试验平均值ʃ标准差,同列上标英文字母表示差异显著性(P =0.05)㊂ + 表示滤纸边缘出现毛边; ++ 表示滤纸弯曲,不成糊状; +++ 表示滤纸不定形,近似糊状; ++++表示滤纸成糊状N o t e :D a t a r e p r e s e n t e d t h em e a n sʃS D (n =3).S u p e r s c r i p t l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t l y di f f e r e n t a t t h e l e v e l o f 0.05(P =0.05). + ,S i n g l e p l u s s y m b o l i n d i c a t e s d e f o r m a t i o no ne d g e o f t h e f i l t e r p a p e r s t r i p . ++ ,D o u b l e p l u s s y m b o l s i n d i c a t e s b e n d i n g o f f i l t e r p a p e r s t r i pe ,b u t n o t i n t h e s h a p e of p a s t e . +++ ,T h r e e p l u s s y m b o l s i n d i c a t e s a b n o r m a l a n d a l m o s t t h e s h a p e o f p a s t e . ++++ ,F o u r p l u s s ym b o l s i n d i c a t e s t h e s h a p e o f c o m pl e t e p a s t e 2.2 酶活性测定上述D /d 平均值较大及滤纸崩解效果较好的6个株系,通过4种纤维素酶活性测定的结果(图2)表明,株系L 7的F P A 酶活性显著高于株系L 9,H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05),株系L 9,L 8-1显著高于H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05)㊂株系L 7和L 8-1的C M C 酶活性显著(P <0.05)高于株系L 9,H 3-1,F 8-2,H 2-1㊂株系L 7的C 1酶活性显著高于株系L 9,L 8-1,H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05)㊂株系L 7和L 9的β-G a s e 酶活性显著高于L 9,H 3-1,F 8-2,H 2-1(P <0.05)㊂综上所述,株系L 7的四种酶活性高于其它株系的分别为4.28,1.89,5.57,2.30U ㊃m L -1为最优株系,其次为株系L 8-1㊂图2 株系的酶活性F i g .2 E n z ym a t i c a c t i v i t i e s o f s t r a i n s 5521草地学报第32卷2.3D/d平均值与纤维素降解菌酶活性相关性分析相关性分析表明(图3),纤维素降解菌D/d平均值的大小与F P A酶活性㊁C M C酶活性㊁C1酶活性㊁β-G a s e酶活性活力呈显著正相关(P<0.05),随着F P A酶活性的增加,株系的D/d值随之变大㊂图3株系D/d值与纤维素酶活性相关性分析F i g.3 C o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e nD/dv a l u e s a n de n z y m a t i c a c t i v i t i e s o f s t r a i n s2.4株系分子生物学鉴定由表2和图4所示,对筛选得到的6个优良纤维素降解株系进行16s r R N A鉴定,将P C R产物测序序列进行B L A S T序列比对(h t t p s://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/)㊂基于16s r D N A基因系列的系统发育分析表明,L8-1株系被鉴定为暹罗芽孢杆菌(B.s i a m e n s i s),H2-1株系和L9株系为枯草芽孢杆菌(B.s u b t i l l u s),H3-1株系为解蛋白芽孢杆菌(B.p r o t e o l y t i c u s),株系L7和F8-2经鉴定属于同一个种高地芽孢杆菌(B.a l t i t u d i n i s)㊂表26个株系的16s r R N A序列同源性比对T a b l e216s r R N As e q u e n c eh o m o l o g y c o m p a r i s o no f6s t r a i n s株系编号S t r a i n c o d e中文菌名C h i n e s e n a m e拉丁学名L a t i nn a m e覆盖率C o v e r a g e/%同源性H o m o l o g y/%序列号G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e rL8-1暹罗芽孢杆菌B.s i a m e n s i s100100K Y643639.1H2-1枯草芽孢杆菌B.s u b t i l l u s99.52MT513998.1L999.52MT513998.1H3-1解蛋白芽孢杆菌B.p r o t e o l y t i c u s100MT573794.1L7高地芽孢杆菌B.a l t i t u d i n i s100MN826596.1F8-2100MN826596.16521第4期陈 欢等:不同来源纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及产酶能力的比较图4 株系L 9,H 2-1,L 8-1,L 7-1,F 8-2和H 3-1基于16s r D N A 序列同源性构建的系统发育树F i g .4 P h y l o g e n e t i c t r e e o f s t r a i n sL 9,H 2-1,L 8-1,L 7,F 8-2,a n dH 3-1b a s e do n16s r D N As e q u e n c eh o m o l o g y3 讨论自然界中产纤维素酶微生物种类很广,包括真菌㊁细菌和放线菌㊂一般真菌产生的纤维素酶活性比细菌高,但细菌具有发酵产酶时间短㊁产纤维素酶使用范围广等优点㊂研究报道,在瘤胃中发现苏云金芽孢杆菌(B .t h u r i n g i e n s i s )㊁巨大芽孢杆菌(B .m e ga t e -r i u m )和蜡样芽孢杆菌(B .c e r e u s)㊁短小芽孢杆菌(B .pu m i l u s )㊁枯草芽孢杆菌(B .s u b t i l i s )均可产纤维素酶,但是酶活不一[12-13]㊂高双喜等[14]从瘤胃中分离的暹罗芽孢杆菌(B .s i a m e n s i s )株系H -7,C M C 酶活性最高为0.18U ㊃m L -1,F P A 酶活性最高为0.44U ㊃m L -1,降解的滤纸条在第3d 接近糊状㊂对于暹罗芽孢杆菌的研究报道较多,主要在抗菌活性[15]㊁产纤溶酶[16]等起作用㊂本研究筛选得到暹罗芽孢杆菌株系L 8-1的酶活性均较高于株系H -7,这表明株系L 8-1降解纤维效果比H -7好㊂同时,也证实暹罗芽孢杆菌具有产纤维素酶的活性,为该菌的进一步应用提供了广泛的空间㊂孙尹双等[17]以奶牛瘤胃液为筛选源得到枯草芽孢杆菌株系B X 1-12,其产纤维素酶活高达27.33U ㊃m L -1㊂D a n -i e l [18]研究发现,在猪饲料中施用枯草芽孢杆菌可以为猪提供酶的来源,有助于营养消化和饲料的利用,从而提高生长效率㊂本研究在瘤胃液中和牛粪便中筛选得到的高地芽孢杆株系L 7和F 8-2也具有一定的产纤维素酶的能力㊂国内外关于解蛋白芽孢杆菌应用研究的报道甚少,解蛋白芽孢杆株系系C F R 3001是从鱼类加工废料中分离的产碱性蛋白酶的细菌,可抑制大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i )㊁单核细胞增生李斯特菌(L i s t e r i am o n o c y t o ge n e s b a c t e r i a L i s t e r )和蜡样芽孢杆菌(B .c e r e u s )等多种病原体的生长[19]㊂本研究在蝗虫的肠道末中筛选得到解蛋白芽孢杆菌株系H 3-1具有一定的产纤维素酶能力,为解蛋白芽孢杆菌功能的进一步研究提供了依据㊂酶活性的不同与株系的种属及纤维素酶的组成有关㊂通过对D /d 值与纤维素降解菌酶活性相关性分析,发现纤维素的酶活性是影响水解圈大小的关键因素㊂纤维素酶是多组分酶,包括葡聚糖内切酶㊁葡聚糖外切酶㊁β-葡萄糖苷酶等㊂F P A 酶活性则代表纤维素酶组分的总活力,反映了3类酶组分的协同作用[20]㊂通过对筛选不同来源株系的酶活性比较,来源于瘤胃液中纤维素降解菌酶活性优于肉牛粪便中降解菌的酶活,来源于蝗虫肠道末的株系酶活性较差,不同降解纤维素的株系酶活不同,这可能与不同株系在不同宿主动物的存活环境有关㊂瘤胃微生物由细菌,真菌及原虫等组成㊂其中,细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)在瘤胃中数量最多,每毫升瘤胃液中细菌数量超过1011个[21]㊂在草料或饲料进入瘤胃时,瘤胃的规律性蠕动使得瘤胃纤维降解7521草地学报第32卷细菌快速与新摄入的草料或饲料发生最初的物理性接触[22]㊂截至目前,已从多种反刍动物的瘤胃中筛选出纤维素降解菌[23-25]㊂而昆虫并没有发达的瘤胃,导致相同菌种的生存环境不同进而导致酶活不同㊂这三种来源的纤维素降解菌各有不同,其他来源(土壤㊁废纸浆㊁温泉等)的纤维素降解菌安全性存在问题,不便直接运用于畜牧业中的饲料加工及饲喂㊂昆虫肠道来源的纤维素降解菌相比于其他来源纤维素降解菌具有更安全的特性,但相比于瘤胃来源的纤维素降解菌,其对木质纤维素的降解能力较弱,所以瘤胃源纤维素降解菌是最好的资源库㊂4结论本研究共筛选出6个降解纤维素能力较强的株系,其中来源于瘤胃液的最强,肉牛粪便次之,蝗虫最弱,为高效纤维素降解株系筛选提供借鉴㊂其中降解能力最强的株系为L7其F P A,C M C,C1和β-G a s e的酶活性分别为4.28,1.89,5.57,2.30 U㊃m L-1㊂筛选得到高效降解纤维素株系为纤维素的处理与加工及饲料生产等提供了微生物资源㊂参考文献[1]李振华,康相涛,刘记强,等.饲用纤维素酶的研究进展及应用现状[J].河南畜牧兽医(综合版),2008(5):10-11 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n v i r o n m e n t a lS c i e n c e a n dB i o/T e c h n o l o g y,2020,19(3):621-648 [25]周泽,付卫刚,雷杨,等.羊粪中纤维素降解菌的筛选㊁鉴定及评价[J].草地学报,2023,31(11):3535-3542(责任编辑刘婷婷)8521。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
高产纤维素酶枯草芽孢杆菌的筛选、应用及其产酶条件研究的开题报告
高产纤维素酶枯草芽孢杆菌的筛选、应用及其产酶条件研究的开题报告一、选题背景纤维素在自工业化以来的几代中一直是一种主要的工业原料，它广泛用于造纸、纤维、食品、能源和医疗等众多领域。
但是，由于极高的相对分子质量和非常结实的结构，纤维素仍然很难分解。
在自然界中，仅仅有一些微生物具有自分解纤维素的能力，其中最著名的一类就是被称为纤维素酶制造细菌。
因此，寻找纤维素酶制造菌是生产纤维素酶的关键。
二、研究目的本研究的主要目的是筛选高产纤维素酶枯草芽孢杆菌并研究其产酶条件，以期为纤维素酶的生产提供基础，同时提高纤维素的利用效率。
三、研究内容1. 枯草芽孢杆菌的分离和纤维素酶活性测定采集自然环境中的样本，使用分离纤维素酶菌的方法，鉴定分离出的枯草芽孢杆菌菌株，测定其产酶能力。
2. 枯草芽孢杆菌的识别和鉴定通过分类学的方法来对分离出的枯草芽孢杆菌的鉴定，进一步确定其物种分类、生态环境等信息。
3. 枯草芽孢杆菌在不同产酶条件下的产酶曲线绘制以实验室条件下对枯草芽孢杆菌的不同降解剂量、pH、温度、时间处理，测定产酶活性及其变化趋势，绘制生长曲线和产酶曲线图。
4. 枯草芽孢杆菌的纤维素酶酶学性质研究测定纤维素酶的酶学性质，如酶的稳定性、酶的特异性、抑制剂对酶的反应等，以推断纤维素的最佳酶解体系。
四、研究意义本研究可以筛选出高产纤维素酶枯草芽孢杆菌，并通过分析产酶条件和纤维素酶的酶学性质，为纤维素酶的生产提供理论基础和技术支持。
五、研究方法本研究主要采用以下研究方法：1. 分离纤维素酶菌并测定其产酶能力。
2. 通过分类学的方法来对分离出的枯草芽孢杆菌的鉴定。
3. 以实验室条件下对枯草芽孢杆菌的不同降解剂量、pH、温度、时间处理，测定产酶活性及其变化趋势，绘制生长曲线和产酶曲线图。
4. 测定纤维素酶的酶学性质，如酶的稳定性、酶的特异性、抑制剂对酶的反应等。
六、研究计划1. 9月-10月：采集样本并分离出纤维素酶菌。
2. 11月-12月：对枯草芽孢杆菌进行分类鉴定，测定其产酶能力。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
环境微生物学实验报告
环境微生物学实验报告环境微生物学实验报告引言：环境微生物学是研究微生物在自然环境中的分布、功能和相互作用的学科。
微生物是地球上最古老、最广泛分布的生物群体之一，对维持生态平衡和生物地球化学循环起着重要作用。
本实验旨在通过采集不同环境样品，分离和鉴定其中的微生物，并探究其在环境中的功能和影响。
实验材料与方法：1. 样品采集：选择不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等，用无菌容器采集。
2. 样品处理：将采集到的样品分别置于无菌试管中，加入适量的生理盐水进行悬浮处理。
3. 稀释与平板计数：将悬浮液进行适当稀释，取适量的样品分别均匀涂布于含有适宜培养基的琼脂平板上，进行菌落计数。
4. 菌落鉴定：根据菌落形态、颜色、质地等特征，选择不同形态的菌落进行纯化和鉴定。
5. 生理与生化特性测试：对纯化的菌株进行生理和生化特性测试，如对温度、pH值的适应性、产酶能力等。
6. 分子生物学分析：通过16S rRNA基因测序，对菌株进行分子鉴定和系统发育分析。
实验结果与讨论：1. 不同环境样品中的微生物种类和数量差异显著。
例如，土壤样品中常见的细菌属有放线菌、假单胞菌等，水体中则常见蓝藻、绿藻等。
这些微生物在不同环境中具有不同的生态功能和适应性。
2. 不同环境中的微生物菌落计数差异较大。
土壤样品中的微生物数量通常较高，而水体样品中则较低。
这与土壤中有更多的有机质和营养物质有关，为微生物提供了更丰富的生存条件。
3. 经过菌落鉴定和分子生物学分析，我们成功鉴定了一些优势菌株。
例如，在土壤样品中，我们发现了一株具有产酶能力的放线菌，其酶活性对土壤有机质分解和养分循环具有重要意义。
4. 微生物的生理和生化特性测试结果显示，不同菌株对环境因素的适应性差异明显。
一些菌株在较高温度和酸性条件下仍能生存和繁殖，而另一些菌株则对这些条件敏感。
这表明微生物在不同环境中的适应性和生存策略存在差异。
5. 通过系统发育分析，我们发现一些菌株与已知的环境微生物具有较高的亲缘关系，说明它们在地球生态系统中具有重要的地位和功能。
细菌的生化实验报告
细菌的生化实验报告细菌的生化实验报告细菌是一类微小而广泛存在于自然界中的生物体，它们在地球上的生物圈中起着重要的作用。
通过对细菌的生化实验，我们可以更深入地了解它们的生物特性和功能。
本文将介绍一系列细菌的生化实验，包括细菌的酶活性、代谢产物以及对环境的影响等方面。
实验一：酶活性研究酶是细菌体内的重要生物催化剂，它们参与了多种代谢过程。
我们可以通过测定细菌体内特定酶的活性来了解其代谢能力。
以大肠杆菌为例，我们可以使用酶活性检测试剂盒来测定其β-半乳糖苷酶活性。
实验结果显示，大肠杆菌中β-半乳糖苷酶活性较高，这表明其在代谢乳糖方面具有较强的能力。
实验二：代谢产物分析细菌的代谢过程会产生各种化合物，这些化合物可以作为细菌代谢的指标。
我们可以通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）来分析细菌培养液中的代谢产物。
以枯草杆菌为例，通过GC-MS分析，我们发现其培养液中存在着丰富的有机酸和氨基酸，这些代谢产物反映了枯草杆菌的代谢途径和能力。
实验三：抗生素敏感性测试细菌对抗生素的敏感性是临床治疗中的重要指标。
我们可以通过纸片扩散法来测试不同细菌株对不同抗生素的敏感性。
实验结果显示，金黄色葡萄球菌对青霉素敏感，而对庆大霉素耐药。
这些结果对于合理使用抗生素和治疗细菌感染具有重要的指导意义。
实验四：细菌对环境的影响细菌在自然界中广泛存在，它们对环境有着重要的影响。
我们可以通过测定细菌在不同环境条件下的生长情况来研究其对环境的适应性。
以耐盐菌为例，我们可以将其分别培养在不同盐浓度的培养基中，观察其生长情况。
实验结果显示，耐盐菌在高盐浓度环境中生长较好，这表明其对高盐环境具有较强的适应能力。
细菌的生化实验为我们深入了解细菌的生物特性和功能提供了重要的手段。
通过研究细菌的酶活性、代谢产物以及对环境的影响，我们可以更好地理解细菌的代谢途径、生态角色以及与人类健康的关系。
这些实验结果对于开发新的抗菌药物、改良环境治理策略以及预防细菌感染具有重要的指导意义。
细菌的生化试验名词解释
细菌的生化试验名词解释细菌是一类微生物，广泛存在于自然界中。
它们是单细胞生物，无真正的细胞核，但却能够执行一系列生化反应。
研究细菌的生化试验是了解细菌的基本生物学特性和进行抗菌药物研发的重要手段。
以下是一些常见的细菌生化试验名词的解释。
1. 嗜热菌试验嗜热菌试验用于检测细菌是否具有耐热能力。
这个试验基于嗜热菌能够在高温环境下生长的特性。
通过将细菌接种在含有特定营养物质的培养基中，并在高温下孵育，观察细菌的生长情况，可以判断其是否为嗜热菌。
2. 酸酶试验酸酶试验用于检测细菌是否能够产生特定的酸酶。
这些酸酶可以将特定的底物分解为酸性产物，从而改变培养基的酸碱度。
通过观察培养基颜色的变化或使用酸碱指示剂，可以判断细菌的酸酶活性。
3. 氧化还原试验氧化还原试验用于检测细菌是否能够对底物进行氧化或还原反应。
这些反应可以生成或消耗氧分子，并产生可见的颜色变化。
通过添加特定的底物和指示剂，可以观察培养基的颜色变化，从而判断细菌的氧化还原能力。
4. 胶原酶试验胶原酶试验用于检测细菌是否能够分解胶原蛋白，一种存在于动物组织中的重要蛋白质。
这个试验基于胶原酶可以将胶原蛋白分解为小分子肽或氨基酸的特性。
通过观察培养基的透明圈或使用特定染料的变化，可以判断细菌是否具有胶原酶活性。
5. 大理石气试验大理石气试验是检测细菌是否具有尿素酶活性的方法。
尿素酶可以将尿素分解为氨和二氧化碳。
这个试验基于细菌产生的氨可与酚红指示剂反应，使培养基呈现鲜艳的红色。
通过观察培养基的颜色变化，可以判断细菌是否具有尿素酶活性。
这些生化试验名词只是细菌研究中的一小部分，不同的试验可以提供不同的信息，从而深入了解细菌的特性。
在细菌学的研究中，这些试验通常与其他分析方法结合使用，以全面了解细菌的生化特性、代谢途径和致病机制，为抗菌药物研发和靶向治疗提供有力的依据。
通过深入研究细菌的生化特性，我们可以更好地理解它们的生存机制，并为人类健康和环境保护提供支持。
酱香型大曲中蛋白酶产生菌的分离鉴定及产酶条件研究
江南大学硕士论文，２００９．
【１６］孙春华．米曲霉菌株的诱变选育及其制剂的应用研究［Ｄ】．泰安：山东 农业大学硕士论文，２００５． ［１７】黄持都，鲁绯，袁圆，等．季节性制曲效果比较研究【Ｊ】．中国酿 造，２０１０（２）：１０７．１１０． ｆｌ ８】林祖申．酱油生产技术的研讨仞．中国酿造，２００３（１６）：１—３
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入酪素水解液０．３札，加琼脂２０９，最后用蒸馏水定容至
１０００ｍＬ。
种子培养基（ｑ：牛肉膏３９、蛋白胨１０９、氯化钠５９、水
１０００ＩｌｌＬ、ｐＨ ７．４￣７．６。
固态发酵培养基：将小麦打磨成肉烂皮不烂呈‘‘梅花 瓣’，状，按小麦干重按一定比例加水浸润４ｈ，制备固态发酵 培养基。
基盒项目：四川省教育厅项目（ＣＣｌｏｚ０１），四川省科技厅项目（２０１０Ⅳ００８１），酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目＠Ｊ２０１１．１２）
摇床培养１２ｈ，转速１６叫ｍｉｎ。以此为种子液以５％接种量接
入三角瓶固态发酵培养基，培养基润水量为４０％，３７℃培养 ７２ｈ。称取２９固体发酵产物，用０．１ｍｏＩ／Ｌ乳酸一乳酸钠缓冲 剂（ｐＨ３．Ｏ）２０ｍＬ浸提，４０。Ｃ水浴中保温１ｈ，并不断地搅拌， 经滤纸过滤后即可得到粗酶液，测定其蛋白酶活力。 蛋白酶活力测定【习：酶活力定义：１９发酵料，在ｐＨ３．０，
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分析细菌的产酶能力
细菌是一类微生物，它们在自然界中广泛分布，同时也是人类健康
与环境中的重要组成部分。
细菌具有多样的代谢方式，其中产酶能力
是其生存与繁衍的关键。
本文将从细菌产酶的意义、细菌产酶的类型
以及细菌产酶的影响因素等方面进行分析。
细菌产酶具有重要意义。
酶是一类生物催化剂，能够促进化学反应
的进行。
细菌通过产生和释放酶，能够分解和转化各种有机物质，满
足其生存与繁殖的需求。
同时，细菌产酶也在环境中具有重要的功能。
例如，一些细菌可以产生纤维素酶和木质素酶，能够降解植物纤维素
和木质素，是生物质资源利用和生物燃料制备的重要工具。
细菌的产酶能力具有多样性。
细菌可产生的酶多种多样，如脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等。
每种酶在细菌的生物代谢中发挥着特
定的作用。
例如，蛋白酶能够降解蛋白质，提供细菌所需的氨基酸；
淀粉酶能够降解淀粉，为细菌提供能量和碳源。
细菌产酶能力的多样
性使其能够适应不同的环境和营养条件，有利于其生存与繁殖。
细菌产酶能力受到多种因素的影响。
首先，细菌产酶能力与其遗传
背景密切相关。
不同细菌菌株之间的酶产量和产酶能力存在差异，这
部分取决于其基因组的差异。
其次，环境条件也对细菌产酶能力有着
直接的影响。
温度、pH值、氧气浓度等环境因素的改变，都会直接影
响细菌的代谢和酶的合成。
此外，培养基的成分也是影响细菌产酶的
重要因素。
细菌在特定培养基中的生长环境与所产生的酶类型和产量
密切相关。
细菌的产酶能力在生物工程和工业生产中具有重要应用。
利用细菌
产酶能力，可以通过发酵和酶切等方式，实现对目标物质的高效转化。
例如，工业上常用的青霉素、链霉素等抗生素的制备，就是利用了细
菌的产酶能力。
此外，细菌产酶还可以被广泛应用于食品、制药和纺
织等行业。
通过对细菌产酶能力的研究和利用，可以实现资源的高效
利用和产品的绿色生产。
综上所述，细菌产酶能力是细菌生物代谢中的重要组成部分。
它对
细菌的生存与繁殖具有关键意义，同时也在环境和工业中发挥着重要
作用。
细菌产酶能力的多样性和受到的影响因素的复杂性，给相关研
究和应用带来了挑战和机遇。
未来的研究方向应当围绕细菌产酶的分
子机制、遗传调控和优化培养条件等方面展开，以实现对细菌产酶能
力的更好理解和利用。