第二章 产酶微生物的分离与筛选
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
第二章 微生物发酵产酶
曲霉、欧文氏菌 啤酒酵母、假丝酵母
水勇果于加工开，始果，汁、才果能酒找澄到清，成麻类纤维脱胶
功的路
制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 制造乳酪
脂肪酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
曲霉、根霉、酵母等 青霉、曲霉 凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工 食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖 生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
第三节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
原生质体 固定化原生质体
培养基
保藏细胞 细胞活化 扩大培养
发酵 分离纯化
酶
固定化细胞
预培养 无菌空气
一、细胞活化与扩大培养
1、生产菌种的来源
（1）购买或筛选
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高； 2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、利于酶的分离纯化； 5、安全可靠，无毒性。（非致病菌）。
二、产酶微生物
菌种是发酵生产酶的重要条件。已经在自然界中 发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有 50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放 线菌、酵母菌、霉菌。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶
α-淀粉酶
葡萄糖淀粉酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶
植酸酶
产酶微生物 枯草芽胞杆菌， 地衣芽胞 杆菌， 米曲霉
米曲霉，黑曲霉，米根霉 枯草芽胞杆菌，米曲霉
地衣芽胞杆菌 黑曲霉，毕赤酵母工程菌株
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。
3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。
5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
第二章 (酶工程)微生物发酵产酶ppt课件
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先 利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生 了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次 生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
C R P c A M P 复 合 物
C R P + c A M P
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA，再翻译为蛋白质。
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合 而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达
产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达摘要：脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，广泛应用于食品、制药和生物工程等领域。
本文旨在概述产脂肪酶微生物的筛选方法以及如何克隆和表达脂肪酶基因。
通过筛选出高产脂肪酶的微生物，并利用基因克隆技术将其基因表达，可以为大规模生产纯脂肪酶提供基础。
1. 引言脂肪酶是一种催化脂质的水解反应酶，广泛存在于微生物中。
它们通过将脂肪酯水解为脂肪酸和甘油，起到重要的催化作用。
因此，寻找高产脂肪酶的微生物，并将其脂肪酶基因克隆和表达，具有重要的应用价值。
2. 产脂肪酶微生物的筛选产脂肪酶的微生物广泛存在于土壤、水体和动物消化系统等环境中。
筛选产脂肪酶微生物的方法主要有：直接筛选法、改进筛选法和基因工程筛选法。
2.1 直接筛选法直接筛选法是最常见也是最简单直接的方法之一。
通过将微生物菌株进行培养，然后检测菌液中产酶能力。
其中，利用酶抑制剂和显色剂的方法可以进行定性和定量的检测。
该方法的优点是操作简便，易于操作。
2.2 改进筛选法改进筛选法通过加入酶诱导剂、化合物诱导剂和高浓度含油样品等方式，提高产脂肪酶的微生物菌株筛选效果。
例如，可使用大豆油、浓缩桔子油等作为诱导剂，增强菌株胞外酶的产酶能力。
2.3 基因工程筛选法基因工程筛选法是利用基因工程技术构建含有脂肪酶基因的表达载体，转化到宿主菌株中，使其表达目标基因并产生脂肪酶。
这种方式可通过对基因进行改造和优化，提高脂肪酶活性和稳定性。
同时，基因工程筛选法还可以利用高通量筛选技术，如流式细胞术和高通量测序技术，提高筛选效率。
3. 脂肪酶基因的克隆和表达脂肪酶基因的克隆和表达是关键步骤，它们可以为脂肪酶的高效生产提供基础。
3.1 脂肪酶基因的克隆脂肪酶基因的克隆可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割和连接等方法实现。
首先，从目标微生物的基因组DNA或环境DNA中提取目标基因的DNA序列。
然后，使用特异性引物进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。
第二章微生物育种的原理和方法
第二章 微生物育种的原理和方法微生物育种原理和方法微生物育种筛选方法微生物育种原理和方法一、微生物育种原理方法：突变、体内重组体外重组（基因工程）1、从自然界中获得新菌种微生物资源分布：土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所2、分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤3、典型的微生物采样和筛选方法生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制不会有代谢产物的积累解除或突破微生物的代谢调节控制目的产物积累微生物育种的目的直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。
往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产二、诱变育种方法1、物理诱变：紫外线2、化学诱变：5-溴尿密啶1）紫外线诱变机理：造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应2）诱变过程中需要注意光复活作用：微生物等生物的细胞内存在光复活酶，光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物（此时的光复活酶没有活性），可见光光能（300-500nm）激活光复活打开二聚体，将DNA复原。
暗修复：细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
紫外诱变的特点：方便、诱变效果很好的常用诱变剂由此说明紫外线照射引起微生物突体形成是一个复杂的生物学过程。
紫外线引起DNA结构的改变仅仅使微生物，于亚稳定状态，点亚稳定到稳定的突变体的形成需要“定时间和过程，所以在实际诱变工作中要采取某些措施避免以上的修复作用，要注意避光或加入某些物质，提高突变的频率。
因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。
3）化学诱变剂诱变机理：5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应注意的参数：参数：浓度、时间、缓冲液三、诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程如下：1）出发菌株的选择A、一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。
第二章 产酶微生物的分离与筛选
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
菌体从椭圆至杆状，单个、 成对或成链，革兰氏阴性， 运动（周毛）或不运动， 不生芽孢。好气。含糖、 乙醇和酵母膏的培养基上 生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡 萄糖异构酶(高果糖浆 )山 梨糖 (维C中间体）
(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2. 化学诱变剂
(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺 烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基， 带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分 别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至 其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其 与DNA中的碱基或磷酸作用。 常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲 基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
2.3.2 突变株的分离与筛选
突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条 件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定 的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的 特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原 养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是 决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以 充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培 养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、 浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。 同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一 致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。
2.2.4 初筛
1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法
2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
诱变剂及其诱发机理
1. 物理诱变剂 物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、X射线、γ射 线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。 生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长 处，该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理 是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子 之间发生交联反应。
a. 交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相 邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形 成。它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对， 造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。
2.3.1 优良菌种的诱变育种
1. 诱变育种 诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散 的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后 采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数
符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究
用。
2 诱变育种方法
诱变育种的基本过程如下：
选择合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱 变处理→筛选→保藏和扩大试验
(6)曲霉(Aspergillus)
分类：多数属于子囊菌亚门， 少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气 和谷物上，可引起食物、谷物 和果蔬的霉腐变质，有的可产 生致癌性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉Asp. Niger、 黄曲霉Asp.flavus 应用：是制酱、酿酒、制醋的 主要菌种。是生产酶制剂（蛋 白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌 种。生产有机酸（如柠檬酸、 葡萄糖酸等）。农业上用作生 产糖化饲料的菌种。
2.2.2 富集培养
1. 添加特殊的营养物质
2. 调整培养基的酸碱度 3. 控制培养温度和热处理
4. 添加抑制剂
2.2.3 分离
通常采用平板分离法。将含菌样品用无菌水 或生理盐水稀释到适当的浓度，然后涂布在 适当的平板上，根据微生物的种类选择培养 条件。根据不同的微生物种类采用不同的培 养基、抑制剂。
Chapter 2 Isolation and Purification of Microorganisms Producing Enzyme
产酶微生物的分离与纯化
酶的生产方法
提取分离法 (Extraction)
生物合成 (Biosynthesis)
化学合成 (Chemicalsynthesis)
(3) 移码突变的诱变剂:吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、
吖啶橙及α -氨基吖啶等)和称为ICR类的化合物 移码突变:是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个 或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面 的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由 移码突变产生的突变体称为移码突变体。 作用机制：它们是一种平面型的三环分子，与嘌呤-嘧 啶碱基对的结构十分相似，故能嵌入两个相邻的DNA 碱基对之间，造成双螺旋的部分解开(两个碱基对原来 相距0.34纳米，当嵌入一个吖啶类分子时，就变成 0.68纳米)，从而在DNA复制过程中，会使链中增添或 缺失一个碱基，结果引起移码突变。
(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著 名的原核生物。
形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0 um，革兰氏阴性，运动 (周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展， 光滑，闪光。 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致 病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要 求低。 应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等
碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤， 并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。胸腺嘧啶被烷 基化后，可与鸟嘌呤错误配对。
(2) 碱基类似物:有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP) 它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被 错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱 基置换的作用是间接的。
Few example
Contents of chapter 2
2.1 产酶微生物
2.2 产酶微生物的分离和筛选
2.3 产酶微生物优良菌种的选育
2.4 产酶微生物原生 常见产酶微生物
基本要求：
不是致病菌 发酵周期短,产酶量高 不易变异退化 最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。 对医药和食品用酶,还应考虑安全性： 凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶, 安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中 毒实验。
（1）出发菌株的选择
a. 自然界直接分离到的野生型菌株
b. 经历过生产条件考验的菌株
c. 已经历多次育种处理的菌株
(2) 制备菌悬液
a. 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性 和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的 措施促使细胞处于同步生长。 b. 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106～ 107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水 (0.85%NaCl)稀释。 表型延迟 Phenotypic lag ：所谓的表型延迟就是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不 纯的菌落。 生理性延迟现象：生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变， 并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变 性状。
2. 化学诱变剂
(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺 烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基， 带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分 别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至 其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其 与DNA中的碱基或磷酸作用。 常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲 基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
2.3.2 突变株的分离与筛选
突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条 件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定 的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的 特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原 养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是 决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以 充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培 养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、 浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。 同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一 致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。
(3) 诱变处理 通常是根据经验选择恰当的诱变剂,对于已有诱变处 理背景的菌株，变换使用其它诱变剂也许会得到较好 的效果。 要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就 一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达 到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对 于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用 高剂量，就是造成菌体致死率在90%～99.9%时的剂 量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰 了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向 于采用低剂量(致死率在70%～80%),甚至更低剂量(致 死率在30%～70%)，他们认为低剂量处理能提高正突 变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。
2.2.4 初筛
1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法
2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法
如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定： (1) 固体培养法 把菌种接入固体培养基中，保温 数天，用水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定 酶活力，这种方法主要适用于霉菌；
(2) 液体培养法 将菌种接入液体培养基后，静置 或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测 定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能 较高的菌种供复筛使用。
2.2.4 初筛
通过平板分离的初筛法得到的产酶军注重， 需要进一步复筛。复筛时可以采用几种代表 性的培养基，在预定的几种培养条件下，对
每一个菌株进行培养，并测定其产酶能力。
由于同一种菌株可因培养方式的不同表现出 不同的产酶能力，因此，最好将摇瓶实验和 小发酵罐实验相结合判断菌株的优良性。
2.3 产酶微生物优良菌种的选育
SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea …… organ/tissue/cell
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture
直状、近直状的杆菌， 周生或侧生鞭毛，革兰 氏阳性，无荚膜，芽孢 0.5×1.51.8m，中生 或近中生。 枯草芽孢杆菌是工业发 酵的重要菌种之一。生 产淀粉酶、蛋白酶、 5’-核苷酸酶、某些氨 基酸及核苷。
(4) 根霉(Rhizopus)
分类学上属于藻状菌纲，毛霉目， 根霉属。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名 （假根的功能是在培养基上固着， 并吸收营养）。 分布于土壤、空气中，常见于淀粉 食品上，可引起霉腐变质和水果、 蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（R.oryzae)黑根 霉(R.nigrican)等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀 粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产 这些酶类的菌种。在酿酒工业上常 用做糖化菌。有些根霉还能产生乳 酸、延胡索酸等有机酸。
暗修复(dark repair) 作用：可修复由紫外 线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。 野生型大肠杆菌细胞的切除修复系统非 但可以修复自身的DNA紫外线损伤，还 能修复外来的噬菌体T1及T3等的DNA所 受到的紫外线损伤。