RealTimeRTPCR常见问题分析
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
RealTimeRTPCR常见问题分析
Real-Time RT-PCR常见问题分析1.某一孔荧光信号特别强问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；3. 部分样本扩增效率过低问题：部分样本扩增效率过低？原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染。
2、模板提取操作有污染。
3、配液过程存在污染。
问题：阴性对照或空白对照翘尾？原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；5. 直线型扩增曲线问题：直线型扩增曲线？原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物；6.没有扩增曲线问题：没有扩增曲线？原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；7.基线下滑问题：扩增曲线有一个下滑阶段？原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；8.扩增曲线断裂问题：扩增曲线断裂？原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据9.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。
PCR常见问题分析及对策
.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
RTPCR常见问题分析
严格控制实验操作过程
总结词
实验操作过程的准确性和规范性对RTPCR实验结果具有重要影响，严格控制实验操作 过程可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
遵循标准的RTPCR实验操作流程，确保每一步操作的准确性和规范性。在实验过程中， 注意避免交叉污染和误差传递，使用一次性吸头和离心管，避免使用污染的工具和容器。
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RTPCR常见问题分析
目录
• RTPCR技术概述 • RTPCR实验过程常见问题 • RTPCR结果解读常见问题 • RTPCR技术改进和优化建议
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术简介
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR），简称RTPCR， 是一种在PCR反应过程中实时监测荧 光信号的分子生物学技术。
同时，对实验操作人员进行培训和考核，确保其具备足够的技能和经验。
完善扩增产物检测方法
总结词
扩增产物检测是RTPCR实验的关键环节，完善扩增产物 检测方法可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
选择灵敏度高、特异性好的检测方法，如荧光定量PCR 、熔解曲线分析等。同时，采用内参基因对实验结果进 行校正和标准化处理，以排除实验过程中可能存在的误 差和干扰因素。此外，应定期对检测方法进行验证和优 化，以确保其性能的可靠性和稳定性。
04
RTPCR技术改进和优化 建议
优化样本采集和保存方法
总结词
详细描述
样本质量是影响RTPCR实验结果的重要因素， 优化样本采集和保存方法可以有效提高实验 的准确性和可靠性。
在采集样本时，应选择适当的采集时间、部 位和数量，避免样本受到污染或降解。采集 后应尽快将样本保存于适当的介质中，并保 持低温，以维持样本的稳定性和活性。
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案！PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规章甚至消逝。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的推断，详细归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对比有条带，而样品则无。
缘由：1、模板:含有抑制物，含量低。
2、Buffer对样品不合适。
3、引物设计不当或者发生降解。
4、反应条件：退火温度太高，延长时间太短。
对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更换Buffer或调整浓度。
3、重新设计引物（避开链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。
4、降低退火温度、延长延长时间。
问题二：非特异性扩增现象：条带与估计的大小不全都或者非特异性扩增带。
缘由：1、引物特异性差。
2、模板或引物浓度过高。
3、酶量过多。
4、Mg2+浓度偏高。
5、退火温度偏低。
6、循环次数过多。
对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR。
2、适当降低模板或引物浓度。
3、适当削减酶量。
4、降低镁离子浓度。
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。
6、削减循环次数。
问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
缘由：1、模板不纯。
2、Buffer不合适。
3、退火温度偏低。
4、酶量过多。
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。
6、循环次数过多。
对策：1、纯化模板。
2、更换Buffer。
3、适当提高退火温度。
4、适量用酶。
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。
6、削减循环次数。
问题四：假阳性现象：空白对比消失目的扩增产物。
缘由：靶序列或扩增产物的交叉污染。
对策：1、操作时应当心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
2、除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
RT-PCR中遇到的问题及解决方法
RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤在是RNA 的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 RT-PCR技术相关试试剂:oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子1.2 方法1.2.1 RNA提取组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）。
转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min。
加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min。
10000 rpm 4℃离心15min。
转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min。
Realtime PCR检测原理和问题处理(技术材料)
技术研究
2
★实时荧光定量PCR检测技术
（Real-time PCR) 定量PCR的数学原理
定量PCR的化学原理
定量PCR的光学原理
技术研究
3
什么是PCR？
技术研究
4
PCR的反应过程
技术研究
5
RT-PCR原理图
技术研究
6
荧光定量PCR的数学原理
1、Baseline (基线) 2、Threshold (阈值)
推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体 补救措施：优化引物浓度和退火温度，专设高温度的收集信号步骤
技术研究
53
实例7：重复性不佳
正常的原始数据
技术研究
54
实例7：重复性不佳
不正常的原始数据
原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。
技术研究
55
疾病监测中常用的反应Mix
ABI公司 AgPath-IDOne Step RT-PCR Kit（货号 AM1005）
8
阈值
阈值= 基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即 PCR扩增信 号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲 线的增长拐点处附近。
技术研究
9Ct值Biblioteka 扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循 环数，即PCR增长信号与 Threshold发生交汇的循环数，也是 FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。
16
定量PCR的数学原理 定量PCR的化学原理 定量PCR的光学原理
技术研究
17
常用的荧光标记方法
1、DNA双链特异性染料 SYBR Green 、SYTO 9、LC Green、Evagreen
2、序列特异性探针
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Real-Time RT-PCR常见问题分析
1.某一孔荧光信号特别强
问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？
原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这
时就要清除热槽中的污染；
2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰
问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？
原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；
3. 部分样本扩增效率过低
问题：部分样本扩增效率过低？
原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；
4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染。
2、模板提取操作有
污染。
3、配液过程存在污染。
问题：阴性对照或空白对照翘尾？
原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；
5. 直线型扩增曲线
问题：直线型扩增曲线？
原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑
制物；
6.没有扩增曲线
问题：没有扩增曲线？
原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；
7.基线下滑
问题：扩增曲线有一个下滑阶段？
原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；8.扩增曲线断裂
问题：扩增曲线断裂？
原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，
阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据
9.样品浓度跨度过大
样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。
10.山坡形曲线
问题：山坡形曲线？
原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。