结核感染t细胞检测tspottb
结核感染T细胞检测ppt课件
种类 特异性
内容摘要
用T-SPOT.TB检测14例鸟分枝杆菌感染者，13例阴性，1例为 临界值，复查也为阴性。
受试者数 量
文献发表
14
Adams et al Sc. J Inf.
Dis..
2008;40(3):196-203.
经过结核筛查的无症状的受试者，T-SPOT.TB检测结果全部为
47
Clark et al. Clin. Exp.
阴性，特异性100%。
Imm.
2007; 150(2):238-44
在德国用T-SPOT.TB对健康的卫生保健工作者进行筛查。仅1 例阳性（1/95） ，为影像学工作者，接触病人超过35年。 TST检测假阳性结果34% （32/95）。
95
Barsegian et al.
J of Hospital Inf
结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴细
胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗原 特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点 数大于20时视为试验有效
在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
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Lee et al.
ERJ 2006; 28:24–30
30
Clark et al. Clin. Exp.
Imm.
2007; 150(2):238-44
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Kang et al Chest.
2007 Sep;132(3):959-65
T-SPOT.TB
优势
• 该检测方法采用的结核杆菌特异性抗原为ESAT-6和CFP-10，其编 码基因RD1在BCG（卡介苗）和绝大多数非结核杆菌中是缺失的， 因此较好的避免了交叉抗原反应，提高了特异性。
原理
1.从全血中分离出外周血单个核细胞PBMCs 2.将样本加入反应孔，每个样本需要4个检 测孔：
①空白对照为了判断非特异细胞的活化反应 ②结核特异抗原A，Panel A(ESAT-6) ③结核特异抗原B，Panel B(CFP 10) ④植物血凝素PHA对照，用于判断PBMC活性
结果
前提：通常正常结果，空白对照孔没有或 有很少的斑点而植物血凝素PHA对照孔斑 点数超过20个。 1.阳性结果：
①空白对照孔斑点数为0～5个且（抗原A或抗原B斑点 数)-（空白对照孔斑点数）≥6 ②空白对照孔斑点数6-10个时且（抗原A或抗原B斑点 数）≥2倍空白对照孔斑点数
2.阴性结果：
不符合上述标准且对照孔正常
• 3.虽然ESAT-6和CFP10在所有的BCG菌株， 以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但TSPOT.TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、 戈登或海分枝杆菌的感染引起的。
临床应用
传染科/感染科： 1.2-3周以上的不明原因发热病人的结核感 染排筛 2.免疫力低下患者肺外结核的辅助诊断 卡介苗接种人群的结核感染筛查 3.HIV感染者并发结核的筛查 T-SPOT.TB不受CD4细胞计数水平的影响， 避免了HIV感染后细胞免疫功能受损而导致 的假阴性结果。
T-SPOT.TB
关于原理与临床应用的ຫໍສະໝຸດ 述• T: T细胞 • SPOT：ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay；酶联免疫斑点 技术)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学 新技术。原理是用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联 斑点显色的方式将其表现出来。 • TB：结核杆菌
结核感染T细胞检测T-SPOT简介与临床应用
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）简介与临床应用汇报人：XXX 单位：XXX结核病T-SPOT 临床应用A B C 目录A 结核病1结核-定义◆肺结核（pulmonary tuberculosis）是结核分枝杆菌复合群（mycobacterium tubercuolsis complex,简称结核分枝杆菌或结核菌）引起的慢性肺部感染性疾病，占各器官结核病总数的80%-90%，其中痰中排菌者称为传染性肺结核病。
1结核-流行病学◆结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，WHO已将其列为重点控制的传染病之一。
据WHO估计全球有1/3人口已感染了结核杆菌，每年约有800万感染者发展为活动性结核病。
◆中国是世界上22个结核病高疫情国家之一，患者总数仅低于印度而居世界第二位。
2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查结果为：活动性肺结核患病率为367/10万，菌阳及涂阳肺结核患病率各为160/10万及122/10万。
◆结核病可侵及全身各器官，其中肺结核为最常见类型，约占85%，菌阳，尤其涂阳肺结核患者是主要传染源，是防治的主要对象。
在肺外结核病中，淋巴结结核、结核性胸膜炎、骨关节结核、泌尿生殖系结核病较多见，此外，还有结核性脑膜炎、结核性心包炎、肝、脾结核、脑结核等。
◆结核病常因各种不同的相关症状而首诊于综合医院临床各科，据统计，80%以上肺结核患者首诊于综合医院。
在内科日常诊疗工作中，无论是长期发热、慢性咳嗽、咳痰、咯血、胸腹腔、心包腔积液及肺部异常阴影等的病因学诊断，结核病是常需注意鉴別的重要病种之一。
2001年7月我国卫生部公布了新的【结核病分类】(WS196-2001)，将结核病分为：◆原发性肺结核；◆血行播散性肺结核；◆继发性肺结核；◆结核性胸膜炎；◆其他肺外结核。
◆原发性肺结核乃是指初次感染结核分枝杆菌而发病者，包括原发综合征及胸内淋巴结结核。
血行播散性肺结核乃是由于机体免疫功能低下，变态反应性增高，肺内原发灶、胸内淋巴结或其他脏器病变内的大量结核分枝杆菌于短期内进入血液循环而引起肺部乃至全身播散性结核病，共包括急性、亚急性及慢性血行播散性肺结核。
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
1520文档结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
一.临床意义：
结核病临床表现复杂多样，可累及全身各个系统，给临床诊断带来很大困难。
本项目检测通过将分离标本中的单个核细胞加入结核分枝杆菌特异性抗原A、B分别进行细胞培养后，分别检测分泌γ干扰素的特异性淋巴细胞的数量诊断结核感染。
本检测诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
二.标本类型、采集及运送要求：
1.采集要求：标本采集后4小时内必须送到实验室，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
2.静脉血：肝素钠（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
三．标本采集时间、结果发放时间及检测频率
1.标本采集时间：每周一上午12点之前采血；并于4小时之内送到临床微生物实验室。
（必要时可与临床微生物实验室联系）
2.结果发放时间：周二下午4点半检验报告发出。
3.检测频率：暂定每周检测一次。
. 1。
T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)
4．用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂。
4．不能用含有Tween或其它去污成分的PBS缓冲液，
这会导致高的本底结果。确保标记抗体工作液有少
量剩余（考虑到耗损）。因而，对于8孔板条（每孔
需要50ul），配制500ul标记抗体工作液，取2.5ul的
浓缩标记抗体试剂加497.5ul的PBS缓冲液
5．每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵 5．不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
3.每吸取100ul细胞终溶液前都必须保证彻底混匀。 推荐每孔加样后都更换新的枪头以避免4个反应孔 出现交叉污染。 4. 为避免干扰，培养板应立即放入孵育箱。不要把 培养板堆叠，会导致温度的不均匀和空气的不流通。 不按照推荐的时间孵育会导致不正确的检测结果。
2.斑点记数
在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹
注意：细胞培养液使用前需预温至 37℃
步骤 1.依照说明书的要求采集全血样本。室温保存 （18-25℃），不能冷冻或冷藏 2.对于使用CPT采血管的，根据厂家说明书要求来分 离PBMCs。 对于其它方法采集血样的，利用Ficoll-PaqueTMPlus 按照操作说明分离PBMCs
3.用吸液管吸取白色、云雾状PBMCs层并转移至15ml 尖底离心管中。加入细胞培养液至10ml。 4.600g离心7分钟。弃去上清液用1ml培养液重悬沉 淀。 5.加培养液至10ml，350g离心7分钟。 6.弃去上清液加0.7ml培养液重悬沉淀。
痕会导致斑点假象，影响斑点记数。
步骤
注意点
1．从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液。
1．此时从试剂盒取出底物显色溶液恢复至室温。
结核感染T细胞检测
T-SPOT.TB高灵敏度
种类
活动性结核/ 灵敏度
内容摘要
将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结 果进行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的 患者。T-SPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI 90.3-99.7%）
在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
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Lee et al.
ERJ 2006; 28:24–30
30
Clark et al. Clin. Exp.
Imm.
2007; 150(2):238-44
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Kang et al Chest.
2007 Sep;132(3):959-65
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴
细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗 原特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数 大于20时视为试验有效
Immunol 2008; 15;168-
71
T-SPOT.TB高特异性 检测所用的ESAT-6＆CFP 10抗原均来自结核
分枝杆菌基因组RD1区域，RD1区基因仅存在于结 核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）。 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因 因此 T-SPOT.TB不会受卡介苗或者非结核分枝杆 菌影响。
32
Kim et al. Arch Intern
Med.
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)简介与临床应用
结核菌的特性和临床检测的现状 又是如何？
1、结核病疫情严重
全球 • 20亿人口感染结核 • 现有活动性结核病患者2000万 • 新增活动性结核病人约900万/年 • 每年200-300万患者死亡
我国
结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印 度，居全球第二位
• 约5.5亿人口感染过结核菌 • 现有活动性肺结核患者450万 • 新发患者145万/年 • 死亡人数13万/年
- 胸部的 X-光或 CT 扫 描显示异常
- 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
活动性结核
• 新发TB病例来自潜伏性结核感 染人群
• 潜伏性结核感染（latent TB Infection, LTBI）人群数量巨 大——“定时炸弹”
全面性
目前检测方法是否满足临床需求？
• 细菌学 • 免疫学
灵敏度 性能不稳定
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）简介 与临床应用
什么是结核病
• 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染 病。结核菌能侵入全身各个器官，但80% 发生在肺部，常称肺结核。
• 结核病又称为“痨病”和“白色瘟疫”， 是一种古老的传染病。
• 人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要 方式。传染源是接触排菌的肺结核患者， 而肺外结核病则不具有传染性。
暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被侦测
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答
- 诊断困难
- 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
机体被感染
受机体免疫力抑制 没有临床症状
终身处于感染状态
潜伏感染
5%
5%
再次激活
有临床症状 具有传染性
探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值
探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值引言：结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，全球范围内仍然是重大公共卫生问题之一。
早期和准确的结核病诊断对于控制疾病的传播和提供有效的治疗举措至关重要。
近年来，结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）逐渐成为结核病的主要诊断工具之一，本文将探讨T-SPOT.TB在结核病中的诊断价值。
一、T-SPOT.TB的原理与技术：T-SPOT.TB是一种利用酶联免疫斑点法检测结核分枝杆菌特异性T细胞反应的技术。
该方法基于测量体外T细胞的干预和测量干预期间T细胞产生的干预细胞因子的原理，通过寻找和计数结核分枝杆菌特异性T细胞的干预斑点来判断人体是否感染了结核分枝杆菌。
二、T-SPOT.TB的优势：与传统的结核诊断方法相比，T-SPOT.TB具有以下显著的优势：1. 高度特异性：T-SPOT.TB能有效区分结核病与非结核分枝杆菌感染，降低了假阳性率，提高了诊断的准确性。
2. 高敏感性：T-SPOT.TB能更早地检测出结核感染，尤其是对于免疫缺陷患者和隐性感染者具有更高的敏感性。
3. 快速结果：T-SPOT.TB的检测结果通常在24小时内可得，对于紧急情况和迅速诊断起到了关键作用。
4. 无交叉反应：T-SPOT.TB不受BCG疫苗和其他非结核分枝杆菌感染因素的影响，避免了传统诊断方法的交叉反应。
三、T-SPOT.TB在结核病中的诊断价值：1. 早期诊断：由于T-SPOT.TB的高敏感性，它能够早期检测出结核感染，避免了疾病的进一步传播，为尽早治疗提供了依据。
2. 预测疾病进展：通过监测T细胞反应的变化，T-SPOT.TB可以评估结核感染的严重程度和预测患者的疾病进展，以便采取及时的干预措施。
3. 监测治疗效果：T-SPOT.TB可以用于评估结核患者的治疗效果，及时调整治疗方案，提高治疗的效果。
4. 作为筛查工具：T-SPOT.TB可以作为结核病的筛查工具，在高感染风险群体中进行广泛的应用，以便早期发现结核感染，减少疾病传播。
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一.临床意义：
????? 结核病临床表现复杂多样，可累及全身各个系统，给临床诊断带来很大困难。
本项目检测通过将分离标本中的单个核细胞加入结核分枝杆菌特异性抗原A、B分别进行细胞培养后，分别检测分泌γ干扰素的特异性淋巴细胞的数量诊断结核感染。
本检测诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
二.标本类型、采集及运送要求：
?? 1.采集要求：标本采集后4小时内必须送到实验室，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
?? 2.静脉血：肝素钠（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
三．标本采集时间、结果发放时间及检测频率
1.标本采集时间：每周一上午12点之前采血；并于4小时之内送到临床微生物实验室。
（必要时可与临床微生物实验室联系）
2.结果发放时间：周二下午4点半检验报告发出。
3.检测频率：暂定每周检测一次。