结核感染t细胞检测方法
T-SPOT_TB操作说明电子版
结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
(仅供参考)结核感染T细胞检测
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）一、背景结核病是由结核分枝杆菌（MTB）引起的传染性疾病。
全世界每年大约有8，000，000新增的结核病例。
据此估计，三分之一的世界人口已被结核杆菌感染并成为潜在的或活动性结核患者。
亚洲结核发病率约占世界结核病发病率的７０％，我国结核发病率则位居世界第二位。
２０００年第四次全国结核病流行病学抽样调查结果估计，我国活动性结核患者约有４５０万人，占全球结核患者总数的１／４，其中痰菌阳性的结核患者约有２００万人，痰涂片阳性的结核患者约１５０万人。
每年约有１３万人死于结核病。
由于卡介苗的使用，现在结核病的发病率比过去有所下降，但是由于艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的使用，酗酒与贫困，难民迁移等诸多因素的影响，结核及其它分枝杆菌所致的感染发病率又呈上升趋势。
如何能够快速、准确的诊断结核病，有效的控制结核病的继续蔓延，已经成为我们首要重视的问题。
然而，目前结核诊断的标准仍局限于临床检查结核细菌培养和涂片直接镜检再辅以X线检查和结核菌素皮肤测试观察。
这些方法均依赖于病人的临床症状，不能达到早期检测潜在结核感染的目的。
结核感染T细胞检测试剂用于肺结核和肺外结核诊断与鉴别诊断具有独特优势：（1）具有非常高的灵敏度和特异性（2）不受环境分枝杆菌感染和卡介苗（BCG）接种影响（3）基本不受机体免疫抑制影响，适用于HIV感染和免疫抑制剂治疗人群（4）简单的实验室血液检查，24小时快速报告结果二、产品的检测原理和方法结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）为英国Oxford Immunotec公司生产，应用的方法学为酶联免疫斑点技术（ELISPOT），产品的检测原理和检测方法如下。
这类反应统称为γ干扰素释放试验（γ Interferon Release Assay, IGRA），目前已经列入美国、欧洲等地结核病诊疗指南，用于结核病辅助诊断。
2．2 产品的检测方法2．2．2 检测过程略：见操作说明三、国内、外已批准上市及应用现状目前结核感染T细胞检测试剂（T-SPOT.TB）已获得欧盟CE认证、美国FDA认证。
结核感染T细胞检测ppt课件
种类 特异性
内容摘要
用T-SPOT.TB检测14例鸟分枝杆菌感染者，13例阴性，1例为 临界值，复查也为阴性。
受试者数 量
文献发表
14
Adams et al Sc. J Inf.
Dis..
2008;40(3):196-203.
经过结核筛查的无症状的受试者，T-SPOT.TB检测结果全部为
47
Clark et al. Clin. Exp.
阴性，特异性100%。
Imm.
2007; 150(2):238-44
在德国用T-SPOT.TB对健康的卫生保健工作者进行筛查。仅1 例阳性（1/95） ，为影像学工作者，接触病人超过35年。 TST检测假阳性结果34% （32/95）。
95
Barsegian et al.
J of Hospital Inf
结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴细
胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗原 特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点 数大于20时视为试验有效
在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
87
Lee et al.
ERJ 2006; 28:24–30
30
Clark et al. Clin. Exp.
Imm.
2007; 150(2):238-44
140
Kang et al Chest.
2007 Sep;132(3):959-65
T-SPOT.TB操作指南[1]
![T-SPOT.TB操作指南[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/2ccb7718c281e53a5802ffa5.png)
– 当阴性对照孔斑点数 ≥ 6 spots, 阳性样本应为:
• (抗原 A 或抗原 B 斑点数) ≥ 2x (阴性对照孔斑点数).
• 如果阳性对照孔结果良好，但抗原A或抗原B均达不到阳性样本 判断标准，则结果为阴性。 • 阳性结果说明患者体内存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。 • 阴性结果提示患者可能不含针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
结核感染T细胞斑点实验 操作指南
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样品采集与制备
• 推荐采用BD Vacutainer® CPTTM柠檬酸钠抗 凝细胞制备真空采血管. • 或肝素锂抗凝采血管，同时准备无菌Ficoll淋 巴细胞分离液。
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样品采集与制准备ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Neubauer Haemocytometer Fast-Read Disposable Counting Slide
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细胞计数与稀释
• 简化方程:
需要的细胞悬液量(ml) = 每个培养孔需要加入细胞数量 /(100,000s) x 需要使用的细胞稀释液量 (ml) 计数的每ml细胞数量 (106 / ml)
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细胞计数及稀释
• 在1.5ml 离心管中加入10µl 已 制备样品细胞悬液和40µl 的 0.4% 台酚兰（trypan blue），制备1：5细胞稀释 液。 • 取10µl 台酚兰/细胞混合悬液 加入血细胞计数板并进行活 细胞计数（可使用自动血细 胞计数仪自动计数）。
结核感染T细胞(TB-IGRA)检测及意义
注：感染后发病与否和机体易感性有关！
复燃
暴露 感染
1% 9%
疾病进展
Latency 潜伏
活动性结核病
2-5% 5-10% HIV>10%
治愈
未根治
一直存在活菌
90%
LTBI 自愈
需预防性服药
细菌全部被清除
不发展为结核病
不需要预防性服药
结核病的免疫主要是细胞免疫
Dheda K, et al.The immunology of tuberculoisis:From bench to beside.Respirogy,2010,15:433-450
目录
contents
1. 结核病的诊断现状
2. TB-IGRA介绍 3. TB-IGRA的临床应用
4. TB-IGRA检测方法及结果解释
临床应用案例
肺结核辅助诊断：
某院呼吸科病人，男 临床症状：发热1周，咳嗽 检测结果：TB-IgG(-)，TB-IGRA（+）T-N的值是21.5pg/ml 结果分析：TB-IgG灵敏度低，易漏检。 临床诊断：肺结核 备注：2011年，WHO建议不再使用结核抗体检测结核感染
•原理: 感染者体内被结核菌（TB）抗原致敏的效应T细胞，
在体外受到相同抗原的刺激（在APC辅助下）后，会分泌大 量IFN- γ(细胞因子)。通过IFN- γ的检测，判断结核感染情况。
12
目录
contents
1. 结核病的诊断现状
2. TB-IGRA介绍 3. TB-IGRA的临床应用
4. TB-IGRA检测方法及结果解释
潜伏性感染监控
一起小规模结核暴发流行的调查与控制
某中学高三年级小规模结核爆发
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
1520文档结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
一.临床意义：
结核病临床表现复杂多样，可累及全身各个系统，给临床诊断带来很大困难。
本项目检测通过将分离标本中的单个核细胞加入结核分枝杆菌特异性抗原A、B分别进行细胞培养后，分别检测分泌γ干扰素的特异性淋巴细胞的数量诊断结核感染。
本检测诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
二.标本类型、采集及运送要求：
1.采集要求：标本采集后4小时内必须送到实验室，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
2.静脉血：肝素钠（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
三．标本采集时间、结果发放时间及检测频率
1.标本采集时间：每周一上午12点之前采血；并于4小时之内送到临床微生物实验室。
（必要时可与临床微生物实验室联系）
2.结果发放时间：周二下午4点半检验报告发出。
3.检测频率：暂定每周检测一次。
. 1。
结核感染T细胞干扰素释放试验要点
4、TB-IGRA阳性，表明机体曾经患过结核病，不能区分目前是否为活动性结核病；
5、TB-IGRA所用抗原为MTB特异性抗原，阴性检测结果代表目前机体没有MTB特异抗原致敏的T淋巴细胞，即受检者目前未感染MTB。
说明：近期有其它细菌感染、慢性病等可能会造成体内γ-干扰素升高，或者近期接受γ-干扰素治疗也会导致体内γ-干扰素水平过高。
免疫缺陷患者，应用免疫抑制剂、肾上腺皮质激素治疗患者，病危病人和免疫能力极其低下，在接受结核杆菌相关抗原刺激时，γ干扰素的分泌比较低，可能会产生阴性结果。
建议对该类患者检测前参考CD4含量水平或者T淋巴细胞水平。
结核感染T细胞(TB-IGRA)/γ-干扰素释放试验
项目名称
标本类型
临床意义
“结核感染T细胞(TB-IGRA)”(又称“γ-干扰素释放试验”）
肝素锂抗凝血（长绿管），采集静脉血不低于4mL
1、可用于结核病辅助诊断，特别是对于菌阴肺结核和肺外结核的辅助诊断有更大的临床意义；
2、潜伏性结核筛查(不受卡介苗接种和环境分枝杆菌的影响)，主要用于生物制剂/免疫抑制剂使用前后的结核感染筛查；
结核感染T细胞检测
T-SPOT.TB高灵敏度
种类
活动性结核/ 灵敏度
内容摘要
将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结 果进行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的 患者。T-SPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI 90.3-99.7%）
在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
87
Lee et al.
ERJ 2006; 28:24–30
30
Clark et al. Clin. Exp.
Imm.
2007; 150(2):238-44
140
Kang et al Chest.
2007 Sep;132(3):959-65
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴
细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗 原特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数 大于20时视为试验有效
Immunol 2008; 15;168-
71
T-SPOT.TB高特异性 检测所用的ESAT-6＆CFP 10抗原均来自结核
分枝杆菌基因组RD1区域，RD1区基因仅存在于结 核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）。 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因 因此 T-SPOT.TB不会受卡介苗或者非结核分枝杆 菌影响。
32
Kim et al. Arch Intern
Med.
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生活常识分享结核感染t细胞检测方法
导语：我们都晓得结核方面的疾病是会传染的，如果患者不能及时接受治疗的话，就会将疾病通过痰传染给其他人，这显然是大家不愿意看到的。
结核感染
我们都晓得结核方面的疾病是会传染的，如果患者不能及时接受治疗的话，就会将疾病通过痰传染给其他人，这显然是大家不愿意看到的。
结核感染的疾病是需要通过结核感染t细胞检测的，很多人对这个检测还不是很了解，下面来听听结核疾病方面的专家是怎么说的吧！
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病。
我国是结核病高负担国家，现有结核病患者499万，传染性患者72万，在法定传染病报告中结核病的发病率和病死率始终占据前两名的位置。
在1979年、1984-1985年、1990年、2000年、2010年5次全国性结核病流行病学抽样调查显示，结核病的发病呈下降趋势，但近20年来我国的结核病患病率下降缓慢，2000年到2010年发病率有上升趋势。
目前，纳入规范治疗管理的结核病患者治愈率达到80%以上，而结核病面临的主要问题是发现率低。
目前以用于肺结核检查方法包括涂片抗酸染色、MTB培养、结核病的分子诊断技术、血清抗体检测、结合菌素实验，这些方法具有各自的优点，但都具有一定方法局限性。
结核感染T细胞检测技术是结核病诊断的新技术。
其基本原理是：结核感染者体内存在特异的效应T 淋巴细胞，经体外全血培养，通过结核分枝杆菌特异性重组抗原刺激感染者效应T淋巴细胞增殖，并释放λ-干扰素(IFN-λ)，通过检测IFN-λ水平，从而判断其是否具有针对结核分枝杆菌特异性的T细胞反应。
该方法特异性好，不受卡介苗接种和环境分枝杆菌的影响;同时灵敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的检出率。
该方法的局限性在于对采集标本要求较高，需要采集新鲜全血，无溶血标本，并需要体。