shRNA设计原则
shrna原理
shrna原理shrna是一种用于基因沉默的工具，它可以通过RNA干扰技术来靶向性地降低特定基因的表达。
shrna的原理主要包括三个方面，shrna的设计、shrna的合成和shrna的作用机制。
首先，shrna的设计是基于靶向基因的mRNA序列来进行的。
在设计shrna时，需要选择一个特定的靶向序列，这个序列通常是基因的编码区域或者保守的非编码区域。
通过选择合适的靶向序列，可以确保shrna能够特异性地干扰目标基因的表达，而不对其他基因产生影响。
此外，为了提高shrna的稳定性和有效性，还需要在设计时考虑到shrna的结构和稳定性，以及靶向序列与mRNA的互补性。
其次，shrna的合成是通过化学合成方法进行的。
一般来说，shrna是由两个部分组成的，一个短的双链RNA序列（通常为21-23个核苷酸）和一个RNA后酶识别序列。
在合成shrna时，需要将这两个部分连接在一起，并且加入适当的限制性内切酶切位点，以便将shrna插入适当的表达载体中。
此外，在合成shrna时还需要考虑到shrna的纯度和稳定性，以确保shrna在细胞内能够有效地发挥作用。
最后，shrna的作用机制是通过RNA干扰来实现的。
一旦shrna进入细胞内，它会与RNA识别蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后RISC会将shrna导向到靶向mRNA上并引发其降解或者抑制其翻译过程，从而达到沉默目标基因的目的。
通过这种方式，shrna可以在细胞内特异性地靶向性地抑制目标基因的表达，从而实现对特定基因的沉默。
总的来说，shrna作为一种基因沉默工具，具有设计灵活、合成简便和作用特异等优点，因此在基因功能研究和基因治疗领域有着广泛的应用前景。
通过深入了解shrna的原理和应用，可以更好地利用这一技术来研究基因功能和开发新的治疗方法。
shrna构建方法
shrna构建方法
shRNA（short hairpin RNA）是一种用于基因沉默的工具，可以通过干扰RNA（RNAi）途径来抑制特定基因的表达。
下面我将从多个角度来介绍shRNA的构建方法。
1. 设计shRNA序列，首先需要设计一个能够特异性靶向要沉默的基因的shRNA序列。
这个序列通常包括一个短的“loop”区域和两个互补的“stem”区域。
设计shRNA序列时需要考虑避免靶向到其他基因，同时确保足够的特异性。
2. 合成DNA片段，一旦设计好shRNA序列，接下来需要合成包含这个序列的DNA片段。
这个DNA片段通常会包括适当的启动子和终止子序列，以便在细胞中进行转录和转录后修饰。
3. 构建shRNA表达载体，合成的DNA片段通常会被克隆到一个适当的表达载体中，这个载体通常包括能够在目标细胞中高效表达shRNA的元件，比如启动子和启动子。
这个载体也可能包括标记基因，比如荧光蛋白，以便在细胞中观察shRNA的表达情况。
4. 验证shRNA的效果，一旦构建好shRNA表达载体，就需要在
细胞系或动物模型中验证shRNA的效果。
这通常包括检测目标基因的表达水平，以确保shRNA能够有效地抑制目标基因的表达。
总的来说，构建shRNA的过程包括设计shRNA序列、合成DNA 片段、构建表达载体和验证效果。
这些步骤需要仔细设计和严格控制，以确保shRNA能够准确、高效地抑制目标基因的表达。
shRNA序列的设计
shRNA序列的设计短发夹RNA (small hairpin RNA，shRNA)可在细胞中被加工成siRNA。
设计shRNA 时，shRNA中两个反向重复序列的设计原则与siRNA序列的设计相同（可参考Transheep SiRNA序列的设计方法），需要重点考虑的是shRNA 环序列的长度及组成，而且环序列不能与靶基因内的其它序列具有同源性。
1 .shRNA环序列的长度一般来讲，设计shRNA时选择3～10 nt长度的发夹环均可。
Brummelkamp等[18]构建了具有5 nt、7 nt、9 nt环的shRNA，比较它们在MCF?7细胞中抑制CHD1基因的效果：9 nt环的shRNA抑制率达90％；7 nt环的shRNA只有中等的抑制率；5 nt环的shRNA 则无抑制活性。
但是Siolas等[8] 报道，环序列的长度对RNAi效率无明显影响。
2.hRNA环序列的组成研究表明，当shRNA发夹环的组成为“UUGAUAUCCG”和“UUCAAGAGA”时具有较高的抑制效率。
当发夹环前面的序列是以“UU”终止时，应该选用“CCACACC”环序列[12]。
环序列中有2个U对产生有效的基因抑制很重要[18]；但环序列中不能有连续3个以上的U[12] ，因为这可能导致shRNA转录的提前终止。
3 .siRNA阴性对照序列的设计所有的RNAi 试验均应设立阴性对照，siRNA 阴性对照序列的合理设计与siRNA 序列的设计同样重要。
因为有效的对照可以充分证明siRNA 只对靶基因产生特异性基因沉默，从而增强实验的可信度。
阴性对照siRNA包括碱基错配或混乱序列的siRNA。
在实验中最好设计两条siRNA 对照序列。
3.1碱基错配的阴性对照siRNA最初的研究证明，在siRNA双链内，一个碱基的突变就足以阻断RNAi 过程。
反义链内具有1～2 个碱基错配的阴性对照siRNA可用于鉴别RNAi 通路和micro RNA 通路，因为后者是由碱基的非精确配对引起。
吉玛公司RNAi设计原则
吉玛公司RNAi设计原则吉玛公司以国际上最先进的设计理念为依托，综合我们对RNAi文库筛选以及从客户反馈的结果，吉玛公司优先考虑的设计原则有以下几个方面：1. siRNA 设计原则1.siRNA双链末端的热稳定性，即的值2.siRNA双链的反义链末端最后两个碱基的选择，即：20，21位置碱基的选择3.siRNA双链的反义链第1和第19位置的碱基的选择4.siRNA反义链的G+C的含量5.siRNA反义链的第2位和第18位置的碱基的选择6.siRNA反义链的第2位到17位局部稳定性的选择7.siRNA双链的正义链为基准，整个双链稳定性的分布为，5’末端稳定性强，双链中间段，以断裂位点周围为例，稳定性较弱，3’段稳定性较弱注：正义链sense:19碱基的靶点+TT悬头反义链antisense:21个碱基完全与靶点互补反义链最后两个碱基为脱氧核酸dNdN2.shRNA设计原则shRNA设计原则与siRNA设计原则相比有其特殊性。
源于shRNA的siRNA相对于外源导入的siRNA在细胞内的有效浓度要低。
shRNA末端设计以及双链的热稳定性是以DNA设计为基础，而siRNA是以mRNA为基础。
1．从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
2．避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
3．siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。
4．在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
5．将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
shrna原理
shrna原理shRNA原理。
shRNA（short hairpin RNA）是一种通过RNA干扰技术来抑制基因表达的工具，它可以在细胞内特异性地沉默目标基因，从而研究目标基因的功能。
shRNA原理主要是通过转染或转染病毒载体将shRNA导入到细胞内，然后shRNA会形成一个茎环结构，被Dicer酶切割成siRNA，siRNA再结合RISC复合物，最终导致目标mRNA的降解，从而实现基因的沉默。
shRNA的设计是shRNA技术的关键，一个有效的shRNA需要具备一定的结构和序列特征。
首先，shRNA需要包含一个稳定的茎环结构，这个结构通常由21-23个碱基组成，茎部由约19个碱基组成，环部由4-6个碱基组成。
其次，shRNA需要具有特定的核苷酸序列，这个序列需要与目标mRNA的特定区域相互匹配。
最后，shRNA的设计还需要避免与其他非特异性的RNA结合，以免产生副作用。
shRNA技术在基因沉默研究中有着广泛的应用，它可以用于研究基因的功能、筛选药物靶点、开发基因治疗等方面。
通过设计特定的shRNA序列，研究人员可以选择性地沉默目标基因，从而观察其对细胞生物学过程的影响。
此外，shRNA技术还可以应用于动物模型中，通过转染病毒载体将shRNA导入到特定组织或器官中，从而研究基因在整个生物体内的功能。
在实际应用中，研究人员需要根据目标基因的特点来设计合适的shRNA序列。
一般来说，shRNA需要选择靶向基因的保守区域，以确保shRNA对不同物种和基因亚型的适用性。
此外，还需要对shRNA序列进行合成和验证，确保其能够有效地抑制目标基因的表达。
在转染实验中，研究人员还需要选择合适的转染剂和转染条件，以确保shRNA能够有效地进入细胞内并发挥作用。
总的来说，shRNA技术是一种有效的基因沉默工具，它在基因功能研究、药物筛选和基因治疗等领域有着广泛的应用前景。
随着对shRNA原理的深入了解和技术的不断改进，相信shRNA技术将会在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
shrna 寡核苷酸序列
shrna 寡核苷酸序列
shRNA是short hairpin RNA的缩写，是一种由RNA分子构成
的小分子，通常用于基因沉默或基因表达调控。
shRNA通常由一个
短的反义RNA序列和一个反向互补的环状RNA序列组成。
这种结构
使得shRNA能够在细胞内通过RNA干涉的方式与特定的mRNA相结合，从而抑制目标基因的表达。
对于shRNA的寡核苷酸序列设计，通常需要考虑到以下几个方面：
1. 目标基因，首先需要确定你想要沉默的目标基因，然后通过
生物信息学工具分析该基因的mRNA序列，以便设计与其相互作用的shRNA序列。
2. shRNA序列设计，设计shRNA序列时，需要确保其具有足够
的亲和力与目标mRNA结合，并且不会与其他非特异性的mRNA结合。
一般来说，shRNA序列应该包括一个反义的“sense”序列和一个“loop”序列，以及一个反向互补的“antisense”序列。
3. 稳定性和副作用，设计shRNA时需要考虑其在细胞内的稳定
性，以及可能的副作用，如触发非特异性的免疫反应等。
4. 实验验证，设计好shRNA序列后，需要进行体外和体内实验验证其对目标基因表达的影响，以确保其有效性和特异性。
总之，设计shRNA的寡核苷酸序列需要充分考虑目标基因的特性和shRNA与mRNA的相互作用，以确保其能够有效地抑制目标基因的表达。
干扰载体构建SOP
shRNA干扰载体构建SOP目录第一部分RNA干扰原理及shRNA设计2第二部分酶切与回收6第三部分退火与连接8第四部分转化与涂平板10第五部分挑菌与菌液PCR11第六部分质粒提取13第一部分RNA干扰原理及shRNA设计标准操作规程(SOP)1.目的：了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列2.仪器与设备：需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5)。
3.操作步骤3.1RNA干扰原理1)RNAi概述：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。
当细胞中导入与源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。
由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。
RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
2)RNAi原理：RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。
在起始阶段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。
证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
shRNA原理及设计
shRNA原理及设计RNAi概述：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。
当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。
由于RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。
RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
RNAi基本原理示意图：RNAi类别：1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。
激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。
化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。
2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA (miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。
3、shRNA干扰载体构建：短发卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA (siRNA, 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。
我们可根据靶标设计短发卡RNA (shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
shRNA实验成功不得不看的shrna 设计原则大总结
RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。
其中shrna设计在慢病毒的构建上应用颇广，本文对shRNA设计原则和操作技巧进行介绍。
1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环( [shRNA shrna 设计原则寡核苷酸酶切位点聚合酶]
RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。
其中shrna设计在慢病毒的构建上应用颇广，本文对shRNA设计原则和操作技巧进行介绍。
1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。
随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3.StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。
5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。
如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。
6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。
不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。
其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测
带有shRNA插入片段的克隆。
在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效(AMBION use)。
7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。
8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。
这可能导致shRNA 转录的提前终止。
9.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
英杰公司总结的siRNA 和shRNA成功必知：在使用Stealth? RNA前优化转染条件，在每次实验中都实验BLOCK-iT?RNAi系列产品，应用RT-PCR进行实验结果分析，知道你想抑制的蛋白质半衰期，始终包含适当的阳性和阴性对照，按照标准准则使用Stealth? RNA对siRNA进行分析。