细菌的血清学及分子生物学检测
布鲁氏菌的血清学检测方法
布鲁氏菌的血清学检测方法布鲁氏菌病（简称布病）是一种人兽共患的传染病，世界范围内流行。
布病给人造成了大量损失和痛苦。
近年由于布病的散发病例的增多，患者多无明确接触史，临床症状又不典型，因此其实验室检测至关重要。
目前布氏菌的实验室检测主要分三类：布氏菌细菌学检测、血清学检测和分子生物学检测。
细菌学检测周期长、阳性率低、感染风险高等特点，分子生物学对仪器、人员、技术的要求较高使得这两类技术在临床诊断应用上不是很普遍，应用最多的还是布氏菌的血清学检测。
本文现就布氏菌的血清学的检测进行如下综述。
布氏菌血清学方法可以分为：凝集法、补体结合法、酶联免疫吸附试验法、荧光偏振法、胶体金层析法等。
其中凝集法是通过特异性抗体与颗粒性抗原结合产生凝集的血清学实验，现应用最多的为虎红平板凝集实验、试管凝集实验、二巯基乙醇试管凝集实验、抗人球蛋白抗体实验等。
虎红平板凝集实验（RBPA）其抗原系用抗原性良好的牛种布氏菌株在适宜培养基上培养收获菌体, 经加热灭活, 离心后用虎红染料染色, 悬浮于乳酸缓冲液（PH3.6-3.7）制成。
它能抑制非特异性反应的IgM和增强特异性IgG 的活性, 其反应敏感稳定, 特异性优于试管凝集实验。
因此PBPA在很多国家推广使用, 是我国常规的诊断方法之一。
RBPA操作简单，不需要大型精密的仪器，适合基层医疗机构和检测点应用。
因有很高的灵敏性且能在短时间内完成，RBPA常用于初筛实验。
其有很高的准确性，特别是当检测1:4稀释血清标本阳性时其诊断的特异性更高【1】。
但RBPA也有局限性，纤维蛋白原可与虎红染料发生非特异性结合形成假阳性【2】，急性病人早期，体内产生的抗体以IgM为主，RBPA可能检测为阴性。
试管凝集实验(SAT)又称莱特试验是1897年由Wright发明，其方法简便，特异性强，可半定量检布鲁氏菌抗体滴度，因此有很高的诊断价值，至今在临床上广泛使用。
我国布病诊断标准中当SAT滴度≥1：100可确诊是活动性布病。
猪的检测项目
实验室对猪病的检测可以采用多种方法和技术。
以下是一些常见的猪病检测方法：
1.血清学检测：通过采集猪的血液样本，进行血清学检测，包括血清抗体检测和血清学指
标检测。
这些检测可以用于确定猪是否感染了特定的病原体，或者是否已经产生了免疫应答。
2.分子生物学检测：分子生物学技术，如聚合酶链反应（PCR）、逆转录聚合酶链反应
（RT-PCR）和核酸杂交等，可以用于检测病原体的核酸序列，从而确定猪是否感染了特定的病原体。
这些方法通常能提供快速、准确的结果。
3.细菌学和真菌学检测：通过细菌培养、细菌鉴定和真菌培养等方法，可以检测猪体内是
否存在细菌或真菌感染。
这些检测方法可以确定病原体的种类和敏感性，以便选择合适的治疗方法。
4.组织学检测：通过取得猪的组织样本，进行组织学检测，如病理学检查、免疫组织化学
染色和组织培养等，可以确定病变的组织学特征，辅助诊断和病因分析。
5.免疫学检测：包括免疫荧光、免疫酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫电泳等方法，可
以检测猪体内特定抗体或抗原的存在，用于诊断感染性疾病。
细菌学检验-4-细菌的分型及其检测技术
质量控制
培养基 菌液浓度 含药纸片 采用标准菌株作对照。
三、稀释法
是体外定量测定抗菌药物抑制待检菌生长活 性的方法。将抗菌药物在液体或固体培养基 中稀释。
肉汤稀释法 琼脂稀释法
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于 M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各 抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内 缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.量取抑菌环直径（mm)， 根据CLSI（clinical and
laboratory standards
敏感（susceptible, S）：表示测试菌能被测定药物常 规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。
中介（intermediate, I）：指最小抑菌浓度（MIC）接 近药物的血液浓度或组织浓度，疗效低于敏感菌。中 介还可作为敏感和耐药的缓冲区，以减少实验条件的 失控而导致较大的错误结果。对于K-B纸片法结果表 现为“中介”的药物，应做定量药敏试验来确证其敏 感性。
institute ）标准，报
告细菌对该抗生素： 敏感(susceptible,S)、 注：NCCLS是美国临床实验室标
准化委员会的英文缩写，推荐的
耐药(resistant,R)、 抗微生物药物敏感性试验操作方 中介(intermediate,I)。法和判断标准被世界上许多国家
和地区所采用。
2005年该委员会更名为临床实验 室标准化协会 CLSI
操作方法 ：
1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为 90mm的平板，其厚度 4mm。
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
细菌感染的分子生物学检验
第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。
6、扩增结核分枝杆菌直接试验（ AMTDT）
AMTDT以结核分枝杆菌的16SrRNA为扩增模板，采 用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化 学发光物吖啶酯标记的cDNA探针与扩增的靶基因杂 交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验除去 未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学 发光信号。
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长
实验室主要技术方法和项目范围
主要技术方法和项目范围
主要技术方法:
细菌的分离培养、血清学分型、生化鉴定；病毒血清学检测、非高致病性病毒的分离、组织培养；病原微生物的分子生物学检测和鉴定、分子生物学分型。
项目范围:
1、卫生微生物学实验：涉及菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群的检测及各种致病菌的增菌和分离工作，对分离到的各种常见的肠道致病菌的鉴定工作；
2、消毒产品与医院消毒监测工作：工作内容同上；
3、传染病细菌监测/检测工作：涉及肠道传染病中的霍乱、伤寒、痢疾等以及呼吸道传染病中的流脑、军团菌等分离培养与鉴定；
4、病毒性传染病检测/监测工作：涉及各种肠道和呼吸道病毒的血清学检测、HIV血清学检测、流感病毒的分离工作，均为已知病原；
5、不明原因肺炎检测/监测工作：对传染性未知、不能预测潜在的感染性的标本，进行多种病原微生物的排查检测，操作包括标本的初步处理和分离物的血清学检测。
检验科中的微生物学检验方法
检验科中的微生物学检验方法微生物学是一门研究微生物种类、结构、属性、繁殖、传播、生理、生化、遗传、分子生物学以及微生物与其他生物和环境的相互关系的科学。
在医学检验中，微生物学检验方法是判断是否存在病原微生物感染、确定感染性疾病种类以及提供治疗方案重要依据之一。
本文将重点介绍检验科中的微生物学检验方法。
一、标本采集及送检微生物学检验的准确性与标本的采集过程息息相关。
标本的采集应遵循严格的操作规程，以保证标本的原始性、新鲜性和无污染。
常见的微生物学标本包括：血液、尿液、痰液、脑脊液、组织、分泌物等。
标本采集后，应迅速送到检验科，并严格按照要求填写送检单，注明标本的来源、采集日期、患者信息等。
送检单的填写要准确、清晰，以免给后续工作带来不必要的麻烦。
二、细菌学检验方法1. 细菌培养方法细菌培养是诊断细菌感染和鉴别不同细菌种类的重要手段。
常用的培养基有营养琼脂培养基、巴斯德培养基、大肠杆菌选择性培养基等。
培养条件包括温度、湿度和氧气浓度等要素的控制。
2. 细菌涂片染色细菌涂片染色是观察细菌形态、结构以及染色性质的常用方法。
常见的细菌涂片染色方法有革兰氏染色、抗酸染色、尼氏染色等。
3. 细菌鉴定方法细菌鉴定是根据其生理生化特性和形态特征，通过一系列实验，确定细菌的种类和属。
常用的细菌鉴定方法包括氧需求实验、生物化学试验、荧光抗体法等。
三、真菌学检验方法真菌感染在临床上常见，因此真菌学检验方法的正确运用具有重要意义。
1. 真菌直接涂片真菌直接涂片是一种快速简便的真菌检测方法，常用于皮肤、黏膜等较浅表部位的感染检测。
常见的涂片染色方法有10% KOH湿润涂片法、格拉姆涂片法。
2. 真菌培养方法真菌培养对于那些深部组织感染或真菌数量较少的病例具有较高的敏感性和特异性。
常用的培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂加酸等。
3. 真菌分子生物学检验真菌分子生物学检验主要通过PCR、实时荧光定量PCR等技术，检测真菌DNA/RNA，实现对真菌的快速准确检测。
布鲁氏菌病血清学检测方法优缺点对比
布鲁氏菌病血清学检测方法优缺点对比王 刚1，范伟兴2，刘 坤2，田丽华3，温建新1（1. 青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3. 青岛西海岸新区动物疫病预防与控制中心，山东青岛 266400）摘 要：布鲁氏菌病（简称布病）严重危害畜牧养殖业安全和人类健康，而有效的检测方法能够为布病的预防、检测和净化提供技术支持。
目前针对布病的血清学检测方法主要包括：布病虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、全乳环状实验（MRT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光偏振测定法（FPA）、补体结合试验（CFT）以及琼脂扩散试验（NH-GD）等。
不同的血清学检测方法各有优缺点：RBT操作简便，敏感性较高，但环境会对检测结果产生一定影响；ELISA敏感性较高，可一次性检测多个样本，但对仪器要求较高；FPA短时间内能够检测大量样品，操作简单，特异性和敏感性与ELISA相似，但需要专业的荧光偏振仪器；SAT特异性较强，但敏感性不高，操作步骤繁琐；CFT的特异性和敏感性都高于SAT，但试验较为繁琐，耗时长；MRT一般只用于牛奶样本检测，无需采血，特异性强，但对牛奶的质量有一定要求；NH-GD对疫苗免疫样本和野毒感染样本具有鉴别诊断能力，但抗原纯度要求高。
因此，RBT、MRT、ELISA、FAP和NH-GD更适合用于布病初筛，而SAT和CFT更加适用于布病复核。
未来应探索更多的血清学检测方法，如荧光微球法、半抗原鉴别诊断方法等，以便为布病检测提供更优选择。
关键词：布鲁氏菌病；血清学；检测方法；优缺点对比中图分类号：S851.3 文献标识码：A 文章编号：1005-944X（2021）05-0072-04DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.05.016Comparison on the Serological Detection Methods for BrucellosisWang Gang1，Fan Weixing2，Liu Kun2，Tian Lihua3，Wen Jianxin1（1. School of Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032，China；3. Qingdao West-Coast Economic New Area Center for Animal Disease Prevention and Control，Qingdao，Shandong 266400，China）Abstract：The animal husbandry safety and human health have been seriously endangered by brucellosis，against which，the prevention，detection and purification could be technically supported by an effective detection method. Current serological detection methods mainly include rose-bengal plate agglutination test（RBT），standard-tube agglutination test（SAT），whole milk ring test（MRT），enzyme-linked immunosorbent test（ELISA），fluorescence polarization Assay（FPA），complement fixation test（CFT）and native hapten-gel diffusion test（NH-GD），which are with different advantages and disadvantages as follows：RBT is user-friendly with high sensitivity，but is subject to environment to some extent；ELISA can detect several samples at one time with high sensitivity，but advanced device will be required；FPA can detect a large number of samples in a short time with similar specificity and sensitivity as ELISA，but a specific fluorescence polarization instrument will be required；SAT is with good specificity but lower sensitivity and complicated operation steps；CFT is with higher specificity and sensitivity compared to SAT，but is收稿日期：2021-02-07 修回日期：2021-02-26基金项目：山东省现代农业产业技术体系特种经济动物创新团队项目（SDAIT-21）通信作者：温建新。
细菌学检验-细菌的分型及其检测技术
告细菌对该抗生素： 敏感(susceptible,S) 、 注：NCCLS是美国临床实验室标
准化委员会的英文缩写，推荐的
耐药(resistant,R) 、 抗微生物药物敏感性试验操作方 中介(intermediate, I)。法和判断标准被世界上许多国家
和地区所采用。
2005年该委员会更名为临床实验 室标准化协会 CLSI
? 质量控制
? 培养基 ? 菌液浓度 ? 含药纸片 ? 采用标准菌株作对照。
三、稀释法
? 是体外定量测定抗菌药物抑制待检菌生长活 性的方法。将抗菌药物在液体或固体培养基 中稀释。
? 肉汤稀释法 ? 琼脂稀释法
? 测MIC（最小抑菌浓度）：某抗菌药物抑制待测
菌生长的最低浓度。
? 测MBC （最小杀菌浓度）：是指能杀灭 99．9％
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于 M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各 抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内 缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.量取抑菌环直径（ mm)， 根据CLSI（clinical and
laboratory standards
第四章
细菌的分型及其检测技术
? 细菌噬菌体分型技术 ? 细菌素分型技术 ? 细菌的药物敏感试验与分型 ? 分子生物学分型技术（略） ? 色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用
（略） ? 细菌的自动化鉴定技术
致病菌的检验程序
标本
直接涂片检查 分离培养 分子生物学技术
其它
(并非所有标本 )
（核酸杂交、 PCR） (HPLC)
? 通过观察是否形成抑菌斑（抑菌区 域），对实验菌进一步分型鉴定。