水中大肠杆菌地检测方法
水中大肠杆菌的检测方法
水中大肠杆菌的检测方法一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在351 ℃、483小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。
二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。
三、干扰(一)水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。
(二)检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。
四、设备(一)量筒：100至1000 mL之量筒。
(二)吸管：有0、1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。
(三)试管：大小约15015 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四)发酵管（fermentation tube）：大小约229 mm 之玻璃管。
(五)稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。
(六)锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。
(七)采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。
(八)冰箱：温度能保持在42℃者。
(九)天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0、01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0、001 g。
()培养箱：温度能保持在351℃者。
(一)高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2 或1、1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
(二)高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
(三)接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。
(四)pH计：精确度达0、1 pH单位。
五、试剂(一)试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。
5.水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)
水中大肠杆菌群书的监测（发酵法）一、试验目的：1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。
2.学习和掌握水中大肠杆菌的监测方法。
二、试验原理：水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。
多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅用于自来水和深井水。
操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。
三、试验材料：1.培养基：乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基2.器材：灭菌三角瓶、无菌平皿、无菌吸管、无菌试管等。
四、试验内容第一天：1.水样的采集自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。
2.用发酵法检查大肠杆菌（1）生活饮用水的检验①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。
摇匀后，37℃培养24ｈ第二天：②平板分离：经24ｈ培养后。
特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。
大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
第三天：③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
第四天：④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查附录1或2，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）五、思考题记录试验结果，并对所测样品作出评价。
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测一般采用以下方法：
1. 高级培养基方法：将取样的水样加入适当的营养培养基中，培养出细菌，并计数大肠菌群的数量。
常用的培养基有大肠杆菌培养基、MacConkey培养基等。
2. 荧光定量PCR方法：通过PCR技术检测水中大肠菌群的DNA，使用荧光探针结构标记大肠杆菌特异性基因，通过测定荧光信号进行定量分析。
3. 流式细胞仪方法：将水样进行染色，然后通过流式细胞仪分析计数大肠菌群的数量。
常用的染色方法有DAPI染色法、荧光活菌染色法等。
4. 基于微生物生物传感器的方法：利用微生物细胞对特定细菌的识别和响应能力，设计合成生物传感器来监测水中大肠菌群的存在和数量。
以上方法可根据实际需要选择使用，各自具有不同的优缺点。
在进行水环境监测时，可以结合多种方法进行检测，以获得准确和可靠的结果。
饮用水中大肠杆菌的检测方法
饮用水中大肠杆菌的检测方法(一)水样的采集供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。
水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。
1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。
如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。
2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。
采样后，瓶内应留有空隙。
如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。
(二)初发酵试验1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。
以此类推，稀释到所需倍数。
2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。
此即5管法。
3.结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。
在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。
若所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。
游泳池水中大肠菌群检验方法
游泳池水中大肠菌群检验方法一、大肠菌群多管发酵法测定1定义大肠菌群（coliform bacteria）系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2 仪器见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。
3培养基和试剂3.1乳糖蛋白胨培养液3.1.1成分：蛋白胨 10g牛肉膏 2g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸馏水 1000mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
3.1.2配法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH到]7.2～7.4。
再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。
3.2伊红美兰琼脂见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.3革兰氏染色液风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.4染色法见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
4推测性试验4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。
4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。
4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。
4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。
5证实试验5.1平板分离自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。
5.2复发酵试验挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。
5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的最大可能数（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。
水中耐热大肠菌群检测方法
水中耐热大肠菌群检测方法水中耐热大肠菌群检测是一种用于评估水质和判断水域环境卫生安全的重要方法。
下面是关于水中耐热大肠菌群检测的10条基本信息以及详细描述：1. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过将水样中的细菌标记并通过流式细胞仪进行检测和计数的方法。
适用于快速分析水样中的大肠菌群含量。
2. 膜过滤法：膜过滤法通过将水样通过膜滤器，筛选并集落大肠菌群，并在适当的培养基上进行培养，可用于定量检测水样中的大肠杆菌。
3. PCR技术：PCR技术通过引物对大肠菌群的DNA进行扩增，从而快速检测水样中的大肠菌群的数量和种类。
可以利用PCR技术进行快速筛选和检测水质。
4. 培养方法：传统的培养方法通过将水样中的细菌在适当的培养基上进行培养，进行形态和生理特性的观察，并通过计数菌落形成单位(CFU)来评估水样中大肠菌群的含量。
5. 颜色指示法：这种方法通过将水样与专门的指示剂配合使用，观察颜色变化以识别大肠菌群污染。
可以通过比较颜色的深浅程度来估计水样中大肠菌群的含量。
6. 微生物生化方法：利用大肠菌群的特定生化反应，如气体产生、酶反应等来判断水样中是否存在大肠菌群污染。
适合用于水样中大肠菌群含量的快速筛查。
7. 荧光显微镜技术：荧光显微镜技术利用特定的荧光探针标记细菌，通过显微镜观察细菌的形态和分布情况，可以用来定性检测大肠菌群。
8. 免疫学检测方法：免疫学检测方法通过检测水样中的大肠菌群特异性抗原或抗体来判断细菌的存在与否。
可以利用快速免疫层析法或ELISA法进行大肠菌群的快速检测。
9. 流动细胞技术：流动细胞技术将水样通过流动细胞仪，利用荧光标记的细胞特异性探针检测水中的大肠菌群。
可用于快速检测水质中大肠菌群的含量和分布。
10. 分子生物学方法：分子生物学方法可以通过分析水样中的DNA或RNA序列，利用特定的引物对大肠菌群进行特异性检测。
使用16S rRNA基因扩增子测序技术可以鉴定水样中的大肠菌群种类和丰度。
水中大肠杆菌的检测方法
附件水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法NIEA 一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ±1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。
二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。
三、干扰(一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。
(二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。
四、设备(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。
(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。
(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。
(六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。
(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。
(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。
(九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。
★水中大肠杆菌群检测方法-滤膜法
附件水中大腸桿菌群檢測方法－濾膜法NIEA E202.53B一、方法概要本方法係用濾膜檢測水中好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、不產芽孢之大腸桿菌群（Coliform group）細菌。
該群細菌在含有乳糖的Endo培養基上，於35 ± 1℃ 培養24 ± 2小時會產生紅色色系具金屬光澤菌落。
所有缺乏金屬光澤的菌落，均判定為非大腸桿菌群。
二、適用範圍本方法適用於地面水體、地下水體、廢水、污水及海域水質及水源水質水樣中大腸桿菌群之檢測。
三、干擾(一) 水樣中含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長之物質。
(二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長的物質。
(三) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫生長（spreading）而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。
四、設備(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有0.1 mL刻度之10 mL之無菌玻璃吸管或無菌塑膠製吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。
(三) 稀釋瓶：100至1000 mL可滅菌、具螺旋蓋之硼矽玻璃製品。
(四) 錐形瓶：200至1000 mL可滅菌之硼矽玻璃製品。
(五) 採樣容器：容量100 mL以上無菌之硼矽玻璃或塑膠製有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。
(六) 培養皿：硼矽玻璃製或可拋棄式塑膠製培養皿，大小為60 × 15 mm、50 × 12 mm 或其他適當大小。
(七) 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。
(八) 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。
(九) 濾膜：使用材質為混合纖維素酯（mixed cellulose esters），直徑47 mm、孔徑0.45 μm且有格子記號的無菌濾膜。
(十) 鑷子：前端平滑、內側無波紋，使用前浸泡於95% 酒精再以火燄燃燒滅菌。
水中耐热大肠菌群检测方法
水中耐热大肠菌群检测方法水中耐热大肠菌群是指在水体中生存繁殖的耐热性强的大肠杆菌及其近缘菌种。
这些菌群可以引起水污染，可能对人类健康造成潜在风险。
因此，水中耐热大肠菌群的检测对于水质评估和公众健康至关重要。
本文将介绍一种常用的水中耐热大肠菌群检测方法。
传统方法：1.涂标法：将水样涂于大肠杆菌选择性琼脂培养基的表面，培养并检测菌落形成。
2.溶解法：将水样固体沉淀后，培养在大肠杆菌选择性琼脂培养基中，培养并检测菌落形成。
这些传统方法的主要优点在于简单易行，但也存在着一些缺点，如操作时间长，对菌种的选择性不够明确，容易产生假阳性和假阴性结果等。
随着生物技术的不断发展，现代分子生物学技术的应用广泛，水中耐热大肠菌群的检测方法也得到了很大的改进和完善。
现代方法：1.PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种高灵敏度的核酸检测方法，可以直接从水样中检测到耐热大肠菌的DNA。
通过PCR扩增特定的基因序列，如16SrRNA基因序列，来进行耐热大肠菌的检测。
这种方法具有高度的特异性和灵敏度，可以快速准确地检测到耐热大肠菌的存在。
2.荧光原位杂交法：荧光原位杂交（FISH）是一种直接在原位上检测特定细菌群落的方法。
通过标记具有亲缘关系的细菌的特定DNA序列，然后在水样中进行原位杂交，通过荧光显微镜观察，并计数特定菌群的数量。
这种方法不仅可以定量，还可以确定细菌群落的分布情况。
3.基于纳米技术的检测方法：近年来，基于纳米技术的检测方法也得到了广泛的应用。
例如，通过使用有特定响应于耐热大肠菌存在的纳米材料，如金纳米颗粒，可以实现对耐热大肠菌的快速检测和定量，并且具有高灵敏度和良好的选择性。
综上所述，水中耐热大肠菌群的检测是十分重要的，可以通过传统方法如涂标法和溶解法，也可以通过现代方法如PCR法、荧光原位杂交法和基于纳米技术的检测方法来进行。
这些方法各有优缺点，需要根据实际需要来选择合适的检测方法。
随着技术的发展和进步，相信将会有更多更高效的水中耐热大肠菌群检测方法被开发出来，为水质监测和公众健康保护提供更好的支持。
纯净水大肠杆菌检测方法
纯净水大肠杆菌检测方法纯净水是一种用于饮用和工业用途的水，在生产和配送过程中，可能会暴露于各种潜在的微生物污染源，其中包括大肠杆菌。
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，它可以被用来作为环境卫生和水质卫生的指标微生物。
因此，检测纯净水中的大肠杆菌含量是必要的，以确保水质符合国家标准和消费者的安全需求。
纯净水大肠杆菌检测方法包括传统培养和分子生物学技术两种方法。
下面将详细介绍这两种方法的原理和应用。
1. 传统培养法传统培养法是一种基于培养大肠杆菌菌落的定量和质量检测方法。
该方法是最常用的水质检测方法之一，可以检测出细菌数量较低的水样品，并且相对简单易行，分析成本较低。
传统培养法的原理是将样品接种到肉汤或营养琼脂培养基中，然后在恰当的条件下孵育，使大肠杆菌繁殖形成典型的圆形、平坦、有光泽、直径约为2mm的蓝色或暗紫色菌落，最终通过计数菌落的数量来确定样品中大肠杆菌的含量。
该方法的优势在于其简单、直观、可重复，并且可以根据环境状况进行某些微生物特定测试。
但是，此测试方法需要培养菌落，所以需要较长时间，必须在8-24小时内进行读数，这可能会影响检测的准确性和效率，尤其是当仅检测少量样品时。
2. 分子生物学技术分子生物学技术是一种基于DNA分析的方法，可以检测到细胞和病毒等微生物的DNA序列。
作为一种新型的检测技术，分子生物学技术的优点在于其高灵敏度、快速性和精确性，它可以解决传统培养法缺点，提高检测灵敏度和准确性。
此外，分子生物学技术还有助于检测未能在传统培养法中检测到的微生物。
分子生物学技术主要包括聚合酶链式反应（PCR）、即时PCR、荧光定量PCR、基因芯片技术等，这些方法可以测量纯净水中微生物或微生物DNA的含量，从而确定大肠杆菌是存在于样品中，其数量的多寡、菌株的种类和亚型、具体DNA 分布等相关信息。
此外，为了提高检测的准确性，还可以使用核苷酸序列分析、基因测序等进一步验证检测结果。
总结在纯净水生产和配送前，进行大肠杆菌检测是必要的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
附件水肠杆菌群检测方法－多管发酵法NIEA E201.54B 一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。
二、适用围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。
三、干扰(一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。
(二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。
四、设备(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。
(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。
(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。
(六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。
(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。
(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。
(九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。
(十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。
五、试剂(一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。
(二) 培养基，应使用市售商品化培养基。
１、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST）1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g乳糖（Lactose） 5.0g氯化钠（NaCl）5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g试剂水1L配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。
灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。
可根据检验需求量，依配方配制培养基。
２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB）1公升的BGLB 培养基中含有下列成份：蛋白胨（Peptone）10.0g乳糖（Lactose）10.0g牛胆粉（Oxgall Powder）20.0g煌绿色试剂（Brilliant Green）0.0133g试剂水1L取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发酵管之试管，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2 ± 0.2。
灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。
可根据检验需求量，依配方配制培养基。
(三) 无菌稀释液１、磷酸二氢钾储备溶液取3.4 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50 mL的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液调节其pH值为7.2 ±0.1，然后加试剂水至100 mL，灭菌（过滤灭菌或121 ℃高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用。
4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。
２、氯化镁储备溶液取8.1 g氯化镁（MgCl2‧6H2O），先溶于少量试剂水，俟完全溶解后，再加试剂水至全量为100 mL，灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。
4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。
３、无菌稀释液分别取10 mL氯化镁储备溶液和2.5 mL磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121℃灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。
如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90 ± 2.0 mL。
4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。
六、采样与保存(一) 盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采样时应避免受到污染。
水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采取加氯之废水时，每100 mL水样中加入0.1 mL、10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L余氯。
采取含氯之饮用水水样时，每100 mL之水样如加入0.1 mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L。
）。
(二) 采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。
(三) 运送时水样温度应维持在小于10 ℃且不得冻结，而实验室保存温度应维持在4 ± 2 ℃。
(四) 水样应于采样后24小时完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤(一)４、），并置入培养箱中培养。
(五) 水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mL。
七、步骤试验分两阶段进行。
首先进行推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。
各试验步骤如下述：(一) 推定试验１、慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。
２、水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。
３、视水样中微生物可能浓度围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10 mL水样至90 mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、1000、10000倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注1）。
４、以无菌吸管分别取各稀释度10 mL水样至含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管不可产生气泡。
５、在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。
(二) 确定试验若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：１、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。
２、利用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。
３、在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时。
４、在48 ± 3小时，BGLB 培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。
八、结果处理(一) 经确定试验确认BGLB试管为阳性反应后，应以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」计算及记录。
5支发酵管连续三种稀释度之MPN可查表一。
(二) 表一所示接种之水样量为10 mL、1.0 mL 及0.1 mL，若所用之稀释度有三种以上时，采用最具意义之三种稀释度，查表后再计算100 mL水肠杆菌群最大可能数。
稀释度之选取方式如下：１、先选取5管均呈阳性反应的最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反应），再选取下两个稀释度（如表二水样别a）。
２、如果稀释度最低的一组并非5管均呈阳性反应，则选取稀释度最低的一组，再选取下两个稀释度（如表二水样别b、c）。
３、如果依据上述原则（１、及２、）选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃原先3组中稀释度最低的一组，纳入下一稀释度的数据（如表二水样别d）。
４、如果依据上述原则（１、至３、）选取3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把更高稀释度之阳性反应试管数加至原先3组中稀释度最高的一组（如表二水样别e）。
(三) 100 mL水肠杆菌群最大可能数（MPN/100 mL）之计算公式如下：结果小于100时，以整数表示（小数字数四舍五入），菌落数大于100以上时，只取两位有效数字：例如110以1.1 × 102表示，16,000以1.6 × 104表示。
(四) 检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养温度及各稀释度的数据等相关数据。
九、质量管理(一) 微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识。
(二) 每批次采样时应进行运送空白。
(三) 每批次或每10个水样需进行试剂空白实验。
(四) 新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E. coli、Enterobacter aerogenes、Citrobacterfreundii）进行测试，以确保数据质量。
(五) 若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试，以确保数据质量。
(六) 本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。
十、精密度及准确度略十一、参考数据(一) APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9221.American Public Health Association, Washington, D.C.(二) Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2003. BD Diagnostic Systems.注1：水样如须稀释，建议于稀释后30分钟完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果。
图一水样稀释步骤表一三连续稀释度（10 mL、1 mL、0.1 mL）五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数及95%信赖区间表二判读说明。