DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)
考染与银染
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色.其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue,CBB)为代表,在蛋白质分析中常用,但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高,却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高,能兼容质谱,但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一.我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
试剂固相pH梯度干胶条(IPG strip pH3—10NL,IPG strip pH5—8,17cm)、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio—Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。
硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂.AgNO3为Sigma公司出品。
Protein molecular weight marker ＃SW0431为MBI公司出品.甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。
仪器IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS—800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。
银染质谱脱色
银染质谱脱色银染质谱脱色是一种常见的实验技术，广泛应用于蛋白质研究中的质谱分析和蛋白质组学研究中。
通过银染质谱脱色技术，我们可以实现对复杂样品中蛋白质的分离、鉴定和定量分析。
下面将从原理、方法和应用三个方面进行详细介绍。
一、原理银染质谱脱色技术是在传统的银染技术基础上发展而来的。
传统的银染技术利用氨基化银络合物与蛋白质中的氨基酸残基和硫醇基团反应，生成一种可见的银沉淀物，从而实现对蛋白质的染色和检测。
而银染质谱脱色技术则在银染的基础上引入了脱色步骤，通过选择性脱除与银染原料不结合的污染物，使得质谱分析所需的样品纯净度得以提高。
常用的脱色方法包括硫代醇还原、溶解交换和鹰式脱色等。
其中，硫代醇还原法是最常用的方法，它可以有效地去除银染剂和产生的银盐，使蛋白质样品能够更好地适应质谱分析的要求。
二、方法1. 样品准备：将待分析的蛋白质样品经过酯胶电泳分离后，将蛋白质条带剪下，并将其放置在含有染料的染色溶液中进行染色反应。
2. 染色反应：将蛋白质条带置于银染溶液中，经过适当时间的染色反应，直至蛋白质条带呈现可见的银染色。
3. 脱色处理：将银染后的蛋白质条带接受脱色处理，通常采用硫代醇还原法。
首先，将蛋白质条带转移到脱色溶液中，作为还原剂的硫代醇将银离子还原为金属银，同时还会发生与氨基酸残基和硫醇基团的结合。
然后，将脱色溶液去除，再进行洗涤处理。
4. 洗涤处理：将脱色处理后的蛋白质条带经过多次洗涤，以除去硫代醇和其他污染物。
常用的洗涤溶液包括酒精、甲醇和乙醇等有机溶剂，以及去离子水等。
5. 干燥处理：将洗涤后的蛋白质条带放置于通风良好的环境中进行干燥处理，或利用专用的脱水设备进行脱水处理。
三、应用银染质谱脱色技术在蛋白质组学研究和质谱分析中扮演着重要的角色，具有以下应用价值：1. 蛋白质分离与鉴定：银染质谱脱色技术能够高效地分离和检测蛋白质，为蛋白质的鉴定提供重要依据。
通过与质谱分析相结合，可以准确地鉴定蛋白质样品中的各个组分。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染) V1.0
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
银染方法
银染方法1.搪瓷盘中倒入2000ml左右70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定15min2.回收乙醇(可重复用3-5次)，蒸馏水洗2遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净3.190ml蒸馏水中加入3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml混匀配成染色液。
倒入染色液，染色30min。
4.倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净5.200ml蒸馏水中加入1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul混匀配成显色液。
倒入显色液显色至清晰。
6.倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍测序板的硅化处理1:每块玻璃板的面都需硅化处理，以防止凝胶与两块玻璃板紧贴并减少电泳完毕后从胶模中取出凝胶时凝胶发生破裂的可能性。
硅化方法为；将拟硅化的玻璃板置于通风橱中，并戴手套操作，在拟硅化板面上加2-3ml 5％二氯二甲基硅烷(二氯二甲基硅烷5％溶于氯仿中)，用纸巾将硅化液涂布均匀，然后用去离子水洗净玻璃板,再用乙醇冲洗后晾干。
如需要从玻璃板上去除原有的硅，可用KOH-甲醇擦拭之。
KOH-甲醇配制为100ml甲醇中加5g片状KOH即可。
测序板的硅化处理2:1.浓度：4%二氯二甲基硅烷2.成分：二氯二甲基硅烷，三氯甲烷4.用途：制备聚丙稀酰胺凝胶时，可用Repel-silane处理小玻板，使凝胶易于剥离。
5.使用方法：测序用玻璃板必须彻底洗净。
先用温水和洗涤剂洗净，用水洗掉洗涤剂,再用去离子水冲洗干净。
最后用乙醇洗板。
1）长玻璃板的处理每次铺胶前均需用亲和硅烷对长玻璃板进行处理。
1、用镜头纸蘸取亲和硅烷溶液少许（1ml左右），涂在长玻璃板上。
要将整块板都涂满、涂匀。
2、4~5分钟后，用95%乙醇洗长玻璃板三次，以去除多余的亲和硅烷。
2）短玻璃板的处理每次铺胶前均需用剥离硅烷对短玻璃板进行硅化处理。
1、处理短玻璃板前先更换手套，以防与亲和硅烷交叉污染。
2、用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（1.5ml左右），涂在短玻璃板上。
实验八核仁组织者区(NOR)的银染显示法
精选ppt课件
4
实验结果
若染色适中，间期核及染色体为金黄色，
油镜观察，可在某些染色体上看到成对的 黑色小点，此即为银染NOR（AgNOR）。
质，参与形成核仁，由于核仁直至前期结束才完
全消散，所以这一部分染色质常常来不及完全收
缩，在中期染色体上，比其它染色质更疏松，因 而被淡染，即表现为次缢痕结构。
每个染色体组中，常有多个NOR。例如人的23
对染色体中，有5对端部着丝点染色体短臂的次
缢痕处为NOR。然而，并不是所有的NOR随时
都出于转录之中。当NOR在间期转录时，产生
精选ppt课件
5
作业
在油镜下绘制一中期分裂相图， 显示Ag- NOR的位置、数目和 形态。
精选ppt课件
6
一种与转录活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留
至中期并能将染液中的银离子还原为金属银而显
现为黑色。所以银染法可在中期染色体上显示具
有转录活性的NOR数目，而且，染色的深黑程
度，还可以反应出基因的活性高低。
精选ppt课件
3
实验方法
银染的具体方法有很多种，如 Ag-AS法,Ag-I法等，我们在此采 用快速银染法，具体操作如下：
若整张片子色淡，间期核及染色体都不易
看清，为染色时间不足，在未滴过香柏油 的情况下，可重新续染。
若染色时间偏长，则染色体为棕色，此时，
仍可看到黑色的NOR，只是NOR与染色
体间的反差较低。染色严重过度时，整张
片子都布满黑色沉淀，这样的标本一般都
银染 protocol
试剂准备（所有试剂均用超纯水制备）：
1）固定液：甲醇50ml，乙酸12ml，甲醛（37%）135ul，加水至100ml；
2）35% 乙醇；
3）2% Na2S2O3：0.1克Na2S2O3用水稀释到5ml使用；
4）染色液（现配现用）：AgNO3 0.1g，甲醛（37%）100ul，加水至50ml；
5）显色液（现配现用）：Na2CO36g，甲醛（37%）135ul，Na2S2O3（2%）20ul，加水至100ml；
6）终止液：甲醇50ml，乙酸12ml，加水至100ml。
步骤：
1）取下2.7电泳分离蛋白样品后的聚丙烯酰胺凝胶，泡在固定液中，摇床上低速、室温固定2h或过夜（以下步骤均可摇床上低速晃动完成）；
2）弃去固定液，加入35%乙醇洗涤，隔20min换新的35%乙醇再次洗涤，共洗三次；
3）弃去35%乙醇，于0.02%的Na2S2O3溶液中激活凝胶，2min；
4）弃去3）的Na2S2O3溶液，用高纯水洗涤凝胶三次，每次5min；
5）弃去高纯水，用染色液浸泡凝胶，染色20min；
6）弃去染色液，用高纯水洗涤凝胶两次，每次1min；
7）弃去高纯水，加入显色液，密切关注显色情况，以清晰看到条带为宜；
8）弃去显色液，加入终止液，5min；
9）弃去终止液，凝胶可泡在1%的乙酸溶液中，4℃保存。
银染电泳实验方法
一、实验名称：银染法-电泳检测目标条带
二、实验目的：测定样品中蛋白组成
三、实验材料
1.主要试剂耗材
名称厂家/品牌
30%丙烯酰胺SIGMA
三羟甲基氨基甲烷Amresco
十二烷基硫酸钠（SDS）北京新经科生物技术有限公司
氯化钠北京化工厂
四、实验内容：
A.加样量计算
B.样品定量，浓度计算，吸取等量的待测样品至各EP管中，向管中加入适当体积的5×SDS凝胶加样
缓冲液，100℃加热5min，使蛋白变性。
C.小心拔出上样梳，按预定的顺序加样，上样量根据所选板子的厚度而定，在预留的一个上样孔中
加入分子量Maker
D.样品煮沸10分钟，13000rpm离心5分钟，取上清。
E.开始电泳，电压150V 跑70min。
F.结束电泳，将15%胶拆开固定15min—水洗6min—致敏5min—水洗1min—银染15min—水洗5s—
显色至条带清晰—终止1min后换水保存。
银染核仁组织区技术方法及应用
银染核仁组织区技术方法及应用
银染核仁组织区技术是一种常用的细胞学染色方法，主要用于观察细胞核仁的形态和数量，并且在病理学检测中有着广泛的应用。
该技术利用银离子的亲和性，使核仁区的核糖体DNA成为黑色或棕色的颗粒，从而使其在显微镜下更加清晰可见。
具体的方法是先将组织切片，并进行脱水和脱蜡处理。
随后在核仁区添加银离子染剂，并通过还原剂促进银离子的还原，使染剂和核糖体DNA发生反应，形成黑色或棕色颗粒。
最后使用显微镜观察细胞核仁的形态和数量。
银染核仁组织区技术在病理学中有着广泛的应用，例如在肿瘤组织中观察核仁大小和数量的变化，以及诊断癌症和炎症等疾病时，都可以使用该技术。
此外，该技术还可以在细胞生物学研究中用于观察细胞核仁的形态和数量变化，从而深入探究细胞的功能和调节机制。
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DNA银染
一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)
1、固定液：50ml乙醇
2、前处理液（敏化液）：5ml HNO3
3、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制）
4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml
5、终止液：50ml 冰醋酸
二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）
1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min；
2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min；
3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S；
4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min；
5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S；
6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；
7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S；
8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；
9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min；
10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。
三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板）
1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA
1、尿素：7.2g
2、30%聚丙酰胺，4.68ml
3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L)
4、30%AP，35ul
5、TEMED,4ul
四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳
12h Treatment24h Treatment
M
CT 0 5 10 200 5 10 20
Protein银染
一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)
1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸
2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入）
3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）
4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml
5终止液：2g甘氨酸
二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）
1、凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；
2、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；
3、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化30min；
4、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；
5、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；
6、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；
7、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；
8、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇10min；
9、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。