分子生物学技术
2024版分子生物学常用技术共35张
电泳法
在电场作用下，利用蛋白质带电 性质和分子大小的差异进行分离， 如SDS-PAGE、双向电泳等。
亲和层析法
利用生物分子间的特异性相互作 用进行分离纯化，如免疫亲和层 析、金属螯合亲和层析等。
蛋白质鉴定和定量分析手段Fra bibliotek质谱法
通过测量蛋白质分子的质 量和碎裂模式进行鉴定和 定量分析，如MALDI-TOF MS、LC-MS/MS等。
信号传导途径涉及多种分子，包括受体、配体、信号转导蛋白和效应器等。
信号传导途径的异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如癌症、神经退 行性疾病等。
受体介导信号传导途径研究方法
01
受体结合实验
利用放射性标记的配体或抗体， 检测受体与配体的结合情况，确 定受体的类型和数量。
02
信号转导蛋白活性 检测
通过检测信号转导蛋白的磷酸化、 去磷酸化等修饰状态，评估其活 性。
发展历程
自20世纪50年代以来，随着DNA双螺旋结构的发现、遗传密码 的破译、基因工程技术的建立等一系列重大突破，分子生物学 迅速崛起并渗透到生物学的各个领域，推动了整个生物科学的 飞速发展。
分子生物学研究内容
基因与基因组研究 包括基因的结构、功能、表达调控以 及基因组的结构、功能与进化等。
DNA复制、转录与翻译
工具使用
BLAST、Bowtie、BWA等软件进行序列比对；CAP3、Velvet、 SPAdes等软件进行序列拼接。
基因结构和功能预测方法
基因结构预测
通过识别编码区、非编码区、启动子、终止子等 元素，预测基因的结构和组成。
基因功能预测
利用基因表达谱、蛋白质互作网络、代谢通路等 信息，预测基因的功能和调控机制。
分子生物学技术
分子生物学技术第一篇：分子生物学技术简介在现代生物学领域中，分子生物学一直在成为一个重要的分支。
分子生物学技术是指通过利用生物大分子（如核酸和蛋白质）的结构、功能和相互作用，并且应用各种技术手段来研究生物学各个领域的过程和现象。
分子生物学技术包括PCR（聚合酶链式反应）、基因组学技术、蛋白质质谱分析、基因编辑技术、CRISPR等。
此外，还有一些深入研究细胞活性和生物分子间相互作用的技术，例如免疫共沉淀、GST pull down等。
PCR技术是现代分子生物学技术的里程碑，被视为分子生物学的“基石”。
PCR技术可以扩增植物、微生物、动物、人类细胞和组织等物种的DNA，并且可以在非常短的时间内扩增一个非常小的DNA片段。
基因组学技术可以检测质粒、细胞、生物样本和组织的基因及其表达的情况。
现代基因组技术已经可以读取大量的基因及其表达信息，可以用于检测一个物种内所有的基因序列，在了解生物基因前提下解析该基因在生物的功能和表达规律。
蛋白质质谱分析可以检测蛋白质组之间的差异，并且可以帮助研究蛋白质结构、功能和相互作用。
基因编辑技术与CRISPR技术相连接，使科学家们能够快速高效地进行基因操纵。
基因编辑技术可以通过人工改变基因，使得特定的序列发生变化，可以用于研究基因的功能和基因治疗等领域。
总的来说，分子生物学技术的发展促进了现代生物学的发展。
无论是学术研究，还是未来医疗、工业和农业领域的应用，都需要分子生物学技术作为基础技术。
第二篇：PCR技术详解PCR是（聚合酶链式反应）的缩写，这是一种灵活、快速、高效、精准的分子生物学技术，用于扩增DNA的特定序列。
PCR技术不仅广泛用于分子生物学研究，还应用于医学、环境监测、食品安全等领域。
PCR技术采用酶促反应而不需要细胞培养或动物宿主，因此可以作为一项独立、快速和低成本的实验技术来进行DNA扩增。
PCR技术的关键在于利用一组半保留的引物（一小段DNA 序列）来选择性扩增在引物之间的目标段。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
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根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
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(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
分子生物学技术
分子生物学技术近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。
人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。
随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。
人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。
相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。
分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。
1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。
随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。
人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。
在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。
一、分子生物学技术由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。
分子生物学常用技术
用途：
RNA（甲醛、乙二醛等）
检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；
比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
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North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记)
⑤底物与抗体-HRP /AP反应, 显色或发光
③杂交：Dig 标记的探针与 靶DNA结合
底物
D│ D│
① 电泳,转膜， 紫外交联固定
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第一节
分子印迹与杂交技术
Molecular Blotting & Hybridization Technology
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一、核酸分子印迹与杂交技术 学习要求 1
印迹(blotting)
指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大 分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成 为固相化分子的过程。
①电泳分离,转膜, 固定蛋白于膜上
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②漂洗和封闭
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优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带
缺点： 1.免疫反应性较低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
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2. Western Blotting间接法操作流程:
⑤底物与二抗-HRP/ AP反应, 显色或发光
• 用Western blotting检测样品中存在特异蛋白质 • 用于细胞中特异蛋白质的定量分析 • 用于蛋白质分子的相互作用研究
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1. Western Blotting直接法操作流程:
④底物与抗体-HRP / AP反应, 显色或发光
分子生物学技术
降温复性。）核酸探针是指带有标记物的已知 序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列 杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中 特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独 特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可 制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
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(一) 核酸探针的种类
1. 中心法则（central dogma）：既遗传信息是 从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白质 而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递，只是
一种理论上的可能性，迄今尚未得到证实。
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2. 密码子：每3个碱基编码一种氨基酸，就会 编码出64种（43=64）不同的氨基酸。蛋白质 分子是由20种不同的氨基酸构成的，因此，1种 氨基酸可有几个不同的密码子，既3个碱基甚
等。 (3) Northern印迹(Northern blot)Northern印迹是指
将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相 支持物上的过程。RNA样品经
第25页，本讲稿共43页
近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交与 固相杂交的主要区别是不用纯化或固定的靶 分子，探针与靶序列直接在溶液里作用。液 相杂交步骤有所简化，杂交速度有所提高， 增加了特异性和敏感性，但与临床诊断所要 求的特异性和敏感性还有一定的距离。 各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最 为广泛，它由以下三个基本过程组成。 1.核 酸印迹技术 (1) 斑点印迹(Dot-blot) 将待测核酸样品变性 后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。
码两种甚至数种的基因产物。
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（四）基因的表达与调控
结构基因(structural gene)：编码细胞成份，如代 谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份等的基因。 调节基因（regulatory gene)：编码控制其他基
分子生物学常用技术
切除所有结合与不 结合蛋白质的DNA 带，并用六氢吡啶 切割甲基化的G残 基
缺失的DNA带表 结合带 非结合带 明相应G残基的重 要意义，它得到 结合蛋白质的保 护
甲基化干扰实验
4、体内足迹实验
完整的细胞 × G G
DMS
裸露的DNA G G
× G
me
G
分离DNA并用 六氢吡啶切割
Me Me
G
G
PCR扩增 凝胶分析
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术一、引言分子生物学是研究生物体的分子结构、功能和相互关系的学科。
分子生物学基本技术是指在分子水平上进行研究的实验技术和方法。
本文将介绍几种常用的分子生物学基本技术。
二、聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应是一种用于扩增DNA片段的技术。
它可以从少量DNA样本中扩增出大量的目标DNA片段。
PCR的原理是通过不断重复DNA的变性、引物结合和DNA合成的过程，使目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR广泛应用于基因克隆、基因检测、遗传学研究等领域。
三、DNA电泳DNA电泳是一种通过电场作用使DNA分子在凝胶中迁移的技术。
DNA的迁移速度与其分子大小成反比，因此可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
在DNA电泳中，DNA样品首先经过限制性内切酶切割，然后在凝胶电泳中进行分离。
最后，通过染色剂染色，可观察到DNA片段的分离结果。
四、基因克隆基因克隆是指将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体等。
基因克隆技术可以用于基因的定位、表达和功能研究。
克隆的基本步骤包括DNA片段的切割、载体与DNA片段的连接、转化等。
五、蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
常用的表达系统包括原核表达系统（如大肠杆菌）和真核表达系统（如哺乳动物细胞）。
表达蛋白质的基本步骤包括构建表达载体、转化表达宿主细胞、诱导表达、蛋白质纯化等。
六、核酸杂交核酸杂交是一种通过DNA或RNA的互补碱基配对形成双链结构的技术。
核酸杂交可用于检测目标DNA或RNA的存在、定位和表达水平。
常用的核酸杂交技术包括Southern blotting、Northern blotting和in situ杂交等。
七、蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用是细胞内发生的重要生物学过程。
研究蛋白质相互作用可以揭示蛋白质的功能和信号转导机制。
常用的蛋白质相互作用研究技术包括酵母双杂交、共免疫沉淀、荧光共振能量转移等。
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（四）基因的表达与gene)：编码细胞成份， 如代谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份 等的基因。
同型多体蛋白质：在多体蛋白质中，如果 所有的亚基都是同样的，这种蛋白质就属 于同型多体（homomultimer）蛋白质，由 一种基因编码。 异型多体（heteromultimer）蛋白质：亚基 各不相同的蛋白质，由多种基因编码。如 血红蛋白。
（二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨 基酸顺序
1. 中心法则（central dogma）：既遗传信 息是从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白 质 而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递， 只是一种理论上的可能性，迄今尚未得到 证实。
降温复性。）核酸探针是指带有标记物的 已知序列的核酸片段，它能和与其互补的 核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待 测核酸样品中特定基因序列的检测。每一 种病原体都具有独特的核酸片段，通过分 离和标记这些片段就可制备出探针，用于 疾病的诊断等研究。
(一) 核酸探针的种类
1.按来源及性质划分 可将核酸探针分为 基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针 和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA 探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广 泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应 (PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克 隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复 制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA探针。
…QABCQDEFQGHIQJKLQ…
（三）基因的结构
基因的编码区（即转录区）是连续不断的 序列，包括一个起始密码子ATG和一个终 止密码子TAA。编码区的两侧是转录而不 转译的侧翼序列区，其中5`非转译区简称 5`UTR，含有一个核糖体结合位点及一个 转录起始信号；3`非转译区简称3`UTR含有 一个转录终止信号。
从基因研究上，操纵子概念比顺反子又进 了一步。即基因不但在结构上是可分的， 而且在功能上也是有分工的。同时，有的 基因控制蛋白质产物的合成，而有的基因 并没有直接的产物。 操纵子模型
二、核酸探测技术
（一）指纹图谱 （二）核酸分子杂交
（一）、指纹图谱
指纹图谱：即核酸酶切图谱，对生物的蛋 白质、DNA和RNA进行分析的电泳图、杂 交放射性自显影图等。在微生物研究上， 主要是用限制性内切酶（ERA）对病毒、 细菌DNA进行酶切分析的图谱。 原理：在微生物（细菌）细胞中有1种限制 性内切酶类（II，称为RE），能特异性的 识别和切割DNA链上特定的一段DNA片段， 这类酶广泛应用于基因工程的各个方面。
调节基因（regulatory gene)：编码控制其他 基因表达的RNA或蛋白质产物的基因。 操纵基因（operator): 指接受来自调节基因 合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录 活性得以抑制的特定的DNA区段，也称为 控制单元。
储藏在基因中的遗传信息分转录和转译两 步进行表达，这种遗传信息从DNA到RNA 再到蛋白质的流向，在所有的细胞类型中 都是受到高度调节的，同时在有些情况下 也是严格协同的。基因表达的此种严格调 控机理，保证细胞不会浪费能量用于合成 它所不需要的基因产物。
因此，顺反子概念表明：基因不是最小单 位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序 列都是基因，而只有其中某一特定的多核 苷酸区段才是基因的编码区。 每一个顺反子就是一段核苷酸序列，或者 是一个基因的DNA或RNA单元，它编码一 种完整的多肽链。顺反子是功能单位，它 是由许多可以突变的位点组成的，而这些 位点之间又可以发生交换。 多体蛋白质（multimeric proteins）：由数 个亚基组成的蛋白质。
无论是真核的基因还是原核的基因，都可 划分成编码区和非编码区两个基本组成部 分。
编码区含有大量的可以被细胞质中转译机 器阅读的遗传密码，包括起始密码子（通
常是AUG）和终止密码子（UAA，UAG或 UGA）。非编码区结构中的5`末端非转译 区（5`UTR）和3`末端非转译区（3`UTR）， 对于基因遗传信息的表述是必要的，但它 们都不会被转译成多肽序列。 真核基因与原核基因的区别：
核酸探针技术
前言
(一) 核酸探针的种类 (二) 核酸探针的制备 (三) 核酸杂交 (四) 核酸探针技术在动物检疫中的应用
前言
化学及生物学意义上的探针(probe)，是指 与特定的靶分子发生特异性相互作用，并 可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、 生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相 互作用都可以看作是探针与靶分子的相互 作用。 核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两 条核酸单链通过退火形成双链，这一过程 称为核酸杂交。（基本过程是：加热变性
ERA就是用RE消化病毒或细菌的DNA或质 粒，将消化物于琼脂凝胶中电泳分离，经
溴化乙锭（EB）染色，然后分析DNA酶切 片段的数目、迁移率等分析微生物的变异
现象、鉴定毒株、分型及了解基因结构和 进行流行病学研究等等。
方法：
1.DNA抽提 2.DNA 酶切 3.电泳 4.染色 5.观察、照相 6.分析 7.酶切图谱
分子生物学技术
一、分子生物学概念 二、核酸探针技术 三、PCR 四、
一、分子生物学概念
（一）基本概念 （二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺 序 （三）基因的结构 （四）基因的表达与调控
（一）基本概念 基因：是编码蛋白质或RNA分子遗传信息 的基本遗传单位。从化学角度观察，基因 则是一段具有特定功能和结构的连续的脱 氧核糖核酸序列，是构成巨大遗传单位染 色体的重要组成部分。 顺反子：顺反子和基因这两个术语是互相 通用的。一般来说，一个顺反子既是一个 基因，大约含有1500个核苷酸对，是由一 群突变单位和重组单位组成的线性结构。
2. 密码子：每3个碱基编码一种氨基酸，就 会编码出64种（43=64）不同的氨基酸。蛋 白质分子是由20种不同的氨基酸构成的， 因此，1种氨基酸可有几个不同的密码子， 既3个碱基甚至更多的碱基编码一种氨基酸 是必要的。
遗传密码是否重叠？研究证实：遗传密码 是不重叠的。
三联体之间是否存在着“逗号”？研究证 实：碱基的阅读是从一个固定的起点按序 进行的，不存在有什么“逗号”的问题。