TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1的酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

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酵母双杂交的原理和应用

酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。

本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。

一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。

该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。

1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。

–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。

当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。

2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。

–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。

二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。

通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。

2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。

例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。

3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。

通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。

4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。

通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。

三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。

酵母双杂交技术原理

酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种常用的遗传交互技术，用于检测蛋白质之间的相互作用关系。

其原理基于两个主要组成部分：DNA 结合域和活化域。

在酵母双杂交系统中，常用的DNA结合域是DNA结合蛋白Gal4，它可以结合在特定的DNA序列上，形成Gal4-DNA复合物。

同时，活化域是Gal4的活化域，它具有激活靶基因表达的能力。

当两个蛋白质相互作用时，可以通过特定的实验设计，将待测蛋白质A与Gal4的DNA结合域、待测蛋白质B与Gal4的活化域结合，从而在酵母细胞中形成Gal4-DNA-A-B的复合物。

这个复合物可以激活靶基因的表达，从而使被激活的基因产生可观察的表型改变（比如生长能力、荧光等），表明蛋白质A 和B之间存在相互作用。

另外，在酵母双杂交系统中引入了质粒的概念，可以通过构建不同的融合质粒来进一步验证蛋白质相互作用的强弱以及特异性。

例如，可以构建融合质粒A-DNA结合域-AD活化域和融合质粒B-DNA结合域-BD活化域，并通过检测酵母细胞的表型改变来判断蛋白质A和B之间的相互作用。

总体来说，酵母双杂交技术基于蛋白质与蛋白质之间的相互作用，通过构建特定的融合质粒和酵母细胞表型改变的观察，来验证蛋白质之间的相互作用关系。

这项技术在生命科学研究中广泛应用，有助于揭示蛋白质网络的复杂关系和功能。

酵母双杂交的原理及其应用

酵母双杂交的原理及其应用1. 引言酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用、识别蛋白质结构域、筛选靶蛋白等。

本文将介绍酵母双杂交的原理及其在科研和药物研发领域的应用。

2. 酵母双杂交的原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录激活因子（TF）和DNA结合域（DBD）的相互作用来探测蛋白质的相互作用。

该技术主要包括两个重要组成部分：诱饵（bait）与猎物（prey）。

2.1 诱饵（bait）诱饵通常是感兴趣蛋白质的DNA结合域（DBD），可以通过基因工程方法将其与转录激活因子（TF）融合，并构建到酵母细胞中。

2.2 猎物（prey）猎物是待测蛋白质，可以将其与激活域融合，并构建到酵母细胞中。

2.3 相互作用检测当诱饵与猎物相互作用时，其融合蛋白质能够形成转录激活复合物。

该复合物能够通过激活报告基因（如LacZ或荧光蛋白）的表达来检测相互作用的发生。

3. 酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在科研和药物研发领域有广泛的应用。

3.1 蛋白质相互作用的研究酵母双杂交技术可以用于筛选和验证蛋白质相互作用的目标。

通过构建不同的诱饵和猎物，可以识别和验证蛋白质相互作用的蛋白质。

3.2 靶蛋白筛选酵母双杂交技术可以用于筛选潜在的靶向蛋白质。

通过将蛋白质库（library）与诱饵进行组合，可以筛选出与诱饵相互作用的猎物，进而识别潜在的靶向蛋白质。

3.3 药物研发酵母双杂交技术可以用于药物研发的初步筛选。

通过将化合物库与诱饵进行组合，可以筛选出与诱饵相互作用的化合物，进而确定潜在的药物候选物。

3.4 蛋白质结构域识别酵母双杂交技术可以用于识别蛋白质的结构域。

通过将蛋白质的不同结构域与诱饵进行组合，可以确定某个结构域的相互作用蛋白质。

4. 结论酵母双杂交是一种有效的蛋白质相互作用研究方法，广泛应用于科研和药物研发领域。

通过酵母双杂交技术，可以识别蛋白质相互作用、筛选靶蛋白等，为蛋白质相关研究和药物研发提供了有力的工具。

用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用

转录激活结构域(AD) (activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。
Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。
Nature，1993，364(6433):121-126.
酵母单杂交系统原理
• 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的 DNA序列取代DNA Gal4结合位点。 • 该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。 • 靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4 P 的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。
克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）
β-半乳糖苷酶
鉴定
（三）阴性干扰
两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。
原因：
融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？
应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体
蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。
蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力
无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。

酵母双杂交试剂及培养基的配置

主要试剂及培养基的配置1、40％葡萄糖：121℃灭菌15min。

2、YPDA液体培养基(1L)：20g/L peptone10g/L yeast extract定容至935ml，PH调至5.8(调之前大约6.6左右)，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入50ml 40％葡萄糖及15ml Ade。

●YPDA固体培养基另加18g/L agar。

3、－Trp－Leu液体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.154g －Trp－Leu定容至95ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖。

●固体培养基另加入1.2-1.5% Agar，以下同上。

注：配缺陷型培养基时，加入缺陷型氨基酸具体的量还要参考药品商标的注明，不同厂家及批次的药品加入的量不同。

4、－Trp液体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.154g －Trp－Leu定容至93ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖及2ml 50×Leu。

5、－Trp－Leu－His固体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.062g －Trp－Leu－His1.2-1.5% Agar定容至95ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖。

6、－Trp－His固体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.062g －Trp－Leu－His1.2-1.5% Agar定容至93ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖及2ml 50×Leu。

7、鲑鱼精DNA（ssDNA）：5mg/ml8、50％PEG：需滤灭。

9、1M LiAc：10、Z buffer：16.1g/L Na2HPO4.7H2O5.50g/L NaH2PO4.H2O0.75g/L KCl0.246g/L MgSO4.7H2OPH调至7.0，灭菌室温保存。

酵母双杂交的原理及其应用

酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，通过构建酵母中的两个蛋白质相互作用所需要的分子间的结合，结合情况可以检测相互作用的程度或强度。

酵母双杂交的原理是基于兰伯特-贝尔特微分方程（Lambert-Beer-Bouguer Law），该方程描述了光强与溶液中物质的浓度之间的关系。

在双杂交中，一对目标蛋白质分别与两个不同的报告蛋白质（通常是启动子与其相应的转录激活因子）结合，形成一个蛋白质复合物。

当这两个蛋白质相互作用时，可以观察到报告蛋白质转录水平的上升。

酵母双杂交的应用广泛，可以用于以下方面：
1. 识别蛋白质-蛋白质相互作用：通过构建大规模的蛋白质相互作用图谱，可以帮助研究人员理解细胞内蛋白质相互作用网络的组织和功能。

2. 确定蛋白质结构和功能：通过和其他蛋白质的相互作用，可以获得相关蛋白质的结构和功能信息。

3. 寻找药物靶点：酵母双杂交可以用于筛选潜在的药物靶点，从而帮助药物研发。

4. 研究疾病机制：通过了解蛋白质之间的相互作用，可以揭示疾病的发生机制，
为疾病的治疗提供新的思路和方法。

总的来说，酵母双杂交技术是一种有效的方法，可以用于研究蛋白质相互作用和功能，对于生命科学研究具有重要的意义。

酵母双杂交的原理

酵母双杂交的原理
酵母双杂交(YeastTwo-hybridSystem，Y2H)是一种具有实验性方法的蛋白质相互作用实验，它可以用来验证和确定两个蛋白在体内及体外之间存在相互作用。

这种蛋白质相互作用可以发生在体内，也可以发生在体外。

在这种实验中，使用的物质是由两个融合的蛋白质组成的双融合蛋白，一个蛋白是结合调控区或结合位点，另一个蛋白质是响应元件，它可以检测到调控区里结合的物质的存在，从而启动一系列的反应，其结果是显示双杂交蛋白中调控区是否与响应元件相结合。

二、酵母双杂交的原理
酵母双杂交的基本原理源于酵母菌的基因调控机制。

它的基本原理是，将一个结合调控区的蛋白（称为“结合蛋白”）与一个响应元件（称为“受体蛋白”）结合起来，当结合蛋白结合到调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会对外在的细胞因子做出反应。

当结合蛋白结合调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会产生一种光变化，从而表明蛋白质之间存在相互作用。

简单地说，酵母双杂交的原理是利用双融合蛋白将一个结合调控区的蛋白和一个响应元件结合在一起，当结合调控区的蛋白结合到结合调控区时，响应元件就会激活，酵母细胞就会产生一些外在细胞因子，如光变化。

从而可以检测到蛋白质之间发生相互作用。

三、酵母双杂交的应用
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用来验证和确定蛋白质之
间的相互作用，也可以用来研究蛋白的结构和功能，并有助于发现新的药物靶标。

此外，它也可以用于研究基因调控机制，研究染色体的结构，以及研究蛋白质和核酸之间的相互作用等。

酵母双杂交实验原理

酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。

酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。

酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。

2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。

3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。

4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。

如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。

通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。

5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。

目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。

LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。

这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。

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上，生长良好，并出现阳性克隆；毒性检测中，将３个诱饵重组载体与空载体在ＳＤ／－Ｔｒｐ液体培养基中的生长情况进行对比，发现诱饵无毒性；自激活检测试验中，重组载体无法在二缺、三缺和四缺培养基中正常生长，证明诱饵无自激活性。因此，本研究成功构建的３个诱饵重组载体可用于３个ＰＲ蛋白互作蛋白的筛选，为进一
ｓｔｕｄｙ。ｔｈｒｅｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｗｅｒｅａｔｔａｃｈｅｄｔｏｙｅａｓｔｔｗｏ — ｈｙｂｒｉｄｂａｉｔｖｅｃｔｏｒＰＧＢＫＴ一７，ａｎｄｔｈｅｎ
ＤＯＩ：１０．１３３２０／ｊｃｎｋｉ．ｊａｕｈ．２０１６．０１３１
．
ＴｃＬｒｌ９ＰＲ、ＴｃＬｒｌ９ＰＲ２和ＴａＬｒｌ９ＴＬＰ１的酵母
双杂交诱饵载体的构建及鉴定
ＰｌａｎｔＰｅｓｔｓｏｆＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ／ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｉｎ
王菲，张艳俊，梁芳，张家瑞，王海燕，刘大群
（河北农业大学植物保护学院／河北省农作物植物病虫害生物防治工程技术研究中心／国家北方山区农业工程技术研究中心，河北保定０７１０００）
摘要：在前期研究的基础上，将成功克隆得到３个病程相关蛋白ＰＲｊ、ＰＲ２和ＰＲ５的序列，分别命名为ＴｃＬＨ９ＰＲ１、ＴｃＬｄ９ＰＲ２和ＴａＬｒｌ９ＴＬＰ１。将这３个基因分别连接到酵母双杂交诱饵载体ｐＧＢＫＴ一７上，并转化到感受态菌株Ｙ２ＨＧｏｌｄ中，检测其毒性和自激活性。结果显示，成功构建了包含目的基因的诱饵重组载体ｐＧＢＫＴ－７一ＴｃＬｒ１９ＰＲ１、ｐＧＢＫＴ－７一ＴｃＬｒ１９ＰＲ２和ｐＧＢＫＴ一７一ＴａＬｒｌ９ＴＩＰ１；将转化产物涂布于ＳＤ／一Ｔｒｐ／Ｘ平板
ＮｏｒｔｈｅｒｎＭｏｕｎｔａｉｎｏｕｓＡｒｅａｓ，Ｂａｏｄｉｎｇ０７１０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓ，ｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ — ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＰＲ】，ＰＲ２，ａｎｄＰＲ５ｎａｍｅｄＴｃＬｒｌ９ＰＲ１．ＴｃＬｒｌ９ＰＲ２ａｎｄＴａＬｒｌ９ＴＬＰ１ｈａｖｅｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｌｏｎｅｄ．Ｉｎｔｈｉｓ
ＷＡＮＧＦｅｉ，ＺＨＡＮＧＹａｎ－ｊｕｎ，ＬＩＡＮＧＦａｎｇ，ＺＨＡＮＧｄｉａ — ｒｕｉ，ＷＡＮＧＨａｌ－ｙａｎ，ＬｉｕＤａ－ｑｕｎ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｂｅｉ／ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌＣｅｎｔｅｒｏｆＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄ
步研究其在小麦与叶锈菌互作中的分子机理奠定基础。关键词：病程相关蛋白；酵母双杂交；诱饵载体；自激活检测；毒性检测
文献标志码：Ａ中来自分类号：Ｑ８１９
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｔｗｏ。－ｈｙｂｒｉｄｂａｉｔｖｅｃｔｏｒｓ０ｆ１ｃＬｒ／９ＰＲ，１１ｃＬｒ／９ＰＲ２ａｎｄＬｒ／９孔Ｐ
第３９卷第６期
２０１６年１１月
河北农业大学学报
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＨＥＢＥＩ
Ｖｏ１．３９Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２０１６
文章编号：１０００—１５７３（２０１６）０６ —００４７ —０５