反转录PCR模板
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
PCR检测技术(一) 模板
3.DNA聚合酶
目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA聚合酶，它是由水生栖热菌(Ther-masaquaticus)产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时光内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃,70℃催化核酸链延伸的速度是2800核苷酸/min，在100uL反应体系中普通用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TagDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是山极端嗜热的激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)产生的DNA聚合酶，是迄今发觉的掺人错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延长速度比TagDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，因为PCR反应以DNA模板举行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，挺直由其将RICA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。
TagDNA聚合酶往往会在DNA链3'末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶(如T4DNA聚合酶)处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。
4．反应缓冲液
PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L(pH8.3～8.8)的Tris-HCl,50mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。反应缓冲液的pH至关重要，假如KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg2+至关重要，它是TagDNA聚合酶活力所必须的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。因为EDTA或磷酸根能影响Mg2+的浓度，所以应注重模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度(dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg2+浓度)。要获得最佳反应结果，必需挑选合适的Mg2+浓度，普通为2～5mmol/L。
反转录pcr名词解释
反转录pcr名词解释
反转录PCR是一种分子生物学技术，也被称为RT-PCR。
它结合了两种技术，聚合酶链式反应（PCR）和反转录（RT）。
这项技术主要用于从RNA模板合成DNA，然后利用PCR技术扩增DNA。
首先，反转录酶（RT酶）将RNA模板转录成互补的DNA链，这个过程称为反转录。
接着，PCR技术被用来扩增这些DNA片段，使其数量呈指数增长。
这使得科学家们能够从极少量的RNA样本中获得足够的DNA，以便进行后续的分子分析，比如基因表达分析或病毒检测。
反转录PCR在许多领域都有重要的应用，特别是在病毒学和基因表达研究中。
例如，它被用于检测病毒感染，如HIV、流感病毒等。
此外，它也被用于研究基因表达在不同条件下的变化，以及在研究中广泛用于克隆和定量分析特定的RNA。
这项技术的发展对于我们理解疾病的发病机制以及基因表达调控等方面具有重要意义。
反转录说明书
整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 7500 Real-Time
PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×）。
*2：制作标准曲线时梯度稀释 cDNA 或 RNA 标准品的稀释液。模板 DNA 或 RNA 如果用水或 TE
Buffer 稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验
结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围
内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和 PCR 反应，用其稀释后的样品可直接使
1×
*
RNase Free dH2O
up to 10 μl
* 反应体系可按需求相应放大，10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。
2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下: 37℃ 15 min（反转录反应） 85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应） 4℃ 注意：得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Real Time PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。
-1-
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1． 5×PrimeScript RT Master Mix 在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于 5×PrimeScript RT
Master Mix 粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。 2． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。 3． 本制品中已经加入了反转录 Primer（Oligo dT Primer 和 Random 6 mers），如果要使用 Gene Specific
反转录pcr操作步骤
反转录pcr操作步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲反转录 PCR 操作步骤。
这可是个很厉害的技术呢！首先呢，你得把要研究的 RNA 样本准备好。
这就好比要烹饪一道美味佳肴，食材可得精挑细选呀！然后把 RNA 模板、反转录酶、引物、dNTP 等这些家伙都按比例放在一起。
这就像是把各种调料恰到好处地混合在一起，才能做出完美的味道。
接下来，把它们放在一个合适的温度下，让反转录酶这个小能手开始工作啦！它就像一个勤劳的小蜜蜂，努力地把RNA 反转录成cDNA。
你想想，这是不是很神奇呀！等反转录完成后，就要进入PCR 阶段啦。
把cDNA、DNA 聚合酶、引物、dNTP 等再次聚在一起，然后设置好温度循环。
这就像一场热闹的舞会，各种分子在不同的温度下欢快地跳动。
在 PCR 过程中，温度的变化可重要啦！就像跳舞的节奏，一会儿高一会儿低。
高温让 DNA 变性，就像把扭在一起的绳子解开；低温让引物结合，就像找到了合适的伙伴牵手；适中的温度让 DNA 聚合酶发挥作用，把新的核苷酸连接上去，就像盖房子一样，一砖一瓦地搭建起来。
每一轮循环结束后，cDNA 的数量就会翻倍呢！就像滚雪球一样，越来越多。
最后呀，等 PCR 反应结束，就可以检测产物啦。
看看我们努力的成果是不是符合预期。
哎呀，反转录 PCR 是不是很有趣呀！它能帮助我们了解那些看不见摸不着的基因信息呢！虽然过程有点复杂，但只要我们认真对待，就一定能掌握好这个技术。
就像学骑自行车一样，一开始可能会摇摇晃晃，但多练习几次就会稳稳当当啦！大家加油哦，相信你们一定能在反转录 PCR 的世界里畅游无阻！。
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。
一步法或两步法反转录cDNA文库的PCR实验原理和流程,gi
一步法或两步法反转录cDNA文库的PCR实验原理和流程,gi逆转录PCR逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。
逆转录PCR是将RNA的逆转录(reverse transcription) 和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。
逆转录PCR实验原理是，提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。
逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
逆转录PCR应用逆转录PCR的用途广泛，可用于分析基因的转录产物、检测细胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探针、直接克隆特定基因的cDNA序列等。
如在临床上RT-PCR可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。
在植物方面RT-PCR常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。
使用RT-PCR检测分析RNA 转录产物具有以下突出的优点：理论上可以检测几乎任何基因的转录产物；可以实现极为微量RNA样品（ng级别）的检测；样品耐受性好，未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测；模板逆转录PCR的模板是RNA，可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，都需确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
RNA提取可以利用试剂盒从细胞（或组织）中提取得到RNA。
模板RNA的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响，从细胞中分离RNA应注意尽量减少RNA酶的污染（RNA酶分布广泛，除细胞内源性RNA酶外环境中也存在大量RNA酶），在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境：避免RNA酶污染包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂抑制内源性RNA酶。
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实验操作步骤：
1）RNA提取：
关键 防止RNA降解
RNA 提取的成功与否 是RT-PCR 检测中最 重要的步骤。
2)逆转录： RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT; 特异引物)
5'
mRNA
cDNA
AAAAAAAA3' TTTTTTTT
思考题
? 结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源 基因转录表达的优缺点。
?RT-PCR—一步法和两步法
两步法：由于单管反应时 RT和PCR都不能在最 佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用 基因特异引物扩增较短的基因，及定量 PCR。两 步法则是将 RT和PCR分别进行，这样使得两个 反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨， 适合那些 GC含量、二级结构严重的模板或者是 未知模板，以及多个基因的 RT-PCR。
Transcripción reversa
GSP1 (sense) 1ra cadena cDNA
AAAAAAAAAA- 3' TTTTTTTTTT- 5'
GSP (antisense)
GSP1
PCR usando GSP+GSP1
GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para dise?ar GSP and GSP1
【结果与分析】
? 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； ? 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的
电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果
实验中应注意的问题
? RNA提取过程中防止降解 ? 去除DNA的污染 ? 实验中注意设置阴性对照 ? 在冰上操作
A）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分
总RNA
2μL（1-5μg）
10×PCR buffer
1μL
dNTPmix（各2.5mM）
2μL
逆转录酶（200u/μL）
0.5μL
Oligo（dT） 或randorm 9 mers
2μL
ddH2O
至10μL
混匀后稍离心，42℃孵育30min，99℃ 5min然后4 ℃保温5min，终止反应后置冰
mRNA
cDNA
PCR 产物
?RT-PCR—一步法和两步法
?一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、 引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA 反转录与PCR 扩增。利用反转录酶和 Taq酶作用在同一体系中直接以 mRNA 为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使 mRNA 的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限 度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测 出总RNA中小于1ng 的低丰度mRNA 。与Taq 酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基 因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。
2、Northern blot (RNA)
3、real-time PCR ( RNA ）
反转录 PCR(RT-PCR)
Oligo dT, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶
mRNA cDNA PCR
用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达
注意问题：
1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段位置 5、mRNA丰度
转基因植物表达的 RT-PCR 检测
实验原理
RNA 的多聚酶反应（ RT-PCR）是以mRNA 为 模板进行逆转录反应（ reverse transcription ， RT）与 PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中 少于10个拷贝的RNA 模板。
RNA 扩增包括两个步骤： ?在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成 RNA的互补cDNA ，加热后cDNA 与RNA 链解离， 然后与另一引物退火，并由 DNA 聚合酶催化引物 延伸生成双链靶 DNA ， 最后扩增靶 DNA.
0.5μL
dd water
补足至 20μL
（C）根据具体的条件设置PCR仪的循环程序：
（D）PCR结束后，取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。
RT-PCR全过程
mRNA (sense)
AAAAAAAAAA- 3' Primer Antisense: TTTTTTTTTT- 5' oligo(dT)o
? 仪器
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微 量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电 泳系统，水漂，恒温水浴。
? 试剂
RNA 反转录酶，3U/μL Taq DNA 聚合酶，PCR缓冲液 （10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模
外源基因的转录表达
基因表达
? 基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA 和翻译成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
? 基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。
目前研究转基因植物外源基因 转录表达的常用方法
1、RT-PCR (RNA)
上。
3) PCR 特异性引物、模板、Taq 聚合酶。
（B）在0.2mL PCR 微量离心管中配制20μL反应体系
10×PCR buffer（含MgCl2） 3μL
2.5mmol/L dNTP
2μLBiblioteka 10μmol/L Primer1
1μL
10μmol/L primer2
1μL
模板CDNA
5μL
3U/μL Taq酶