遗传病基因诊断-2015-2016学年
2015-2016学年高二生物导学案：4-1《转基因生物的安全性》(新人教版选修3)
高二生物选修三《现代生物科技专题》导学案（编号4—1）班级：姓名：小组：检查人：评价∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽∽课题：转基因生物的安全性主备人：审核人：授课人：使用时间：年月日【学习目标】1．关注转基因生物的安全性问题，认同对生物技术安全性问题讨论的必要性。
2．举例说明对转基因生物安全性问题的不同观点及论据。
3．形成对待转基因生物安全性问题的理性、求实的态度【重点难点】重点：1．对转基因生物的安全性问题多层面、多角度的关注。
2．运用生物学知识对不同观点的依据进行辨析和讨论。
难点：从关注整个生物圈的和谐、稳定与发展的高度去审视转基因生物的安全性。
【自主学习】一、阅读教材P87-88内容---转基因成果1．微生物方面(1)制造出具有重要经济价值的各种重组微生物，如清除石油污染的_______________。
(2)使用___________ ____，生产稀缺的生化药物，即_______________。
2．转基因动物方面(1)在培育_____________、________ _______的转基因家畜、家禽方面不断取得辉煌成就。
(2)科学家把转基因动物(如奶牛)变成_______________，让它们的奶中富含某种营养物质、____________或人类所需要的____________。
3．转基因植物方面(1)成果：目前科学家已经培育出了大批具有________、_______、抗除草剂、______等全新性状的农作物。
(2)推广国家及品种：全球种植转基因农作物的国家已经有十几个，种植面积最大的前四个国家分别是________、________、________和________，其中以种植________ _______最多，其次是______ _________和_________。
二、阅读教材P88-91内容---对转基因生物安全性的争论内容(1)转基因生物与食物安全①引起食物安全问题的理由：反对“实质性等同”，因为对食物安全性检测不仅要检测其_____ __________，还应包括其他方面的测试结果；担心出现_______________，因为转基因植物的DNA经过重组后，有可能合成出对人体有________ ____，食者在过了若干年或者一两代之后，问题才显现出来；担心出现_____________；担心_____________改变，因为尽管转基因农作物只是部分DNA发生重组，但是有些基因足以使植物体内某些______________发生改变，从而导致转基因农作物营养成分的改变；把动物蛋白基因转入农作物，是否侵犯了_______________或_________的权益。
遗传病基因诊断的实验方法
遗传病基因诊断的实验方法遗传病基因诊断是一种通过检测和评估患者基因信息的方法,以确定患者是否携带特定的遗传病基因。
近年来,随着分子生物学和基因测序技术的不断发展,遗传病基因诊断的实验方法也变得越来越成熟和精确。
本文将介绍遗传病基因诊断的实验方法,并对其进行拓展。
一、遗传病基因诊断的实验方法1. 基因扩增和测序基因扩增是遗传病基因诊断的基础。
通过将患者基因组DNA提取并扩增,可以得到一定长度的DNA片段。
然后,对该DNA片段进行测序,可以确定其序列信息。
通过比对患者和参考基因组的序列信息,可以确定患者是否携带特定的遗传病基因。
2. 单基因遗传病基因诊断单基因遗传病通常是由单个基因变异引起的疾病。
单基因遗传病基因诊断的实验方法通常包括以下步骤:(1)基因组DNA提取:从患者体内提取基因组DNA,并将其保存在DNA片段大小在500-2000nt之间的条件下。
(2)PCR扩增:对基因组DNA进行PCR扩增,以获得足够长度的DNA片段。
(3)测序:对扩增后的DNA片段进行测序。
(4)比对:将测序得到的序列信息与参考基因组的序列信息进行比对,以确定患者是否携带特定的单基因遗传病基因。
3. 多基因遗传病基因诊断多基因遗传病通常是由多个基因变异引起的疾病。
多基因遗传病基因诊断的实验方法通常包括以下步骤:(1)基因组DNA提取:从患者体内提取基因组DNA,并将其保存在DNA片段大小在500-2000nt之间的条件下。
(2)PCR扩增:对基因组DNA进行PCR扩增,以获得足够长度的DNA片段。
(3)测序:对扩增后的DNA片段进行测序。
(4)比对:将测序得到的序列信息与参考基因组的序列信息进行比对,以确定患者是否携带特定的多基因遗传病基因。
二、遗传病基因诊断的拓展1. 精确度遗传病基因诊断的精确度取决于实验方法和参考基因组的选择。
一般来说,现代遗传病基因诊断方法的精确度可以达到99%以上。
但是,在某些情况下,例如杂合子患者或参考基因组存在大量变异的情况下,精确度可能会降低。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(146)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 真核生物mRNA多数为多顺反子，而原核生物mRNA多数为单顺反子。
（）答案：错误解析：2. 糖酵解在有氧无氧条件下都能进行。
（）[暨南大学2013研]答案：正确解析：糖酵解过程不需要氧气的参与。
3. 如果一个人被发现不能合成IMP，那么可以给此人定期静脉注射外源的IMP，以解决其嘌呤核苷酸不能从头合成的问题。
（）答案：错误解析：4. 黄嘌呤氧化酶的底物只有黄嘌呤。
（）答案：错误解析：5. 非循环式光合磷酸化既可产生ATP，也可产生O2和NADPH。
（）答案：正确解析：非循环式光合磷酸化电子沿Z形传递，直至NADP＋产生NADPH，电子传递过程中产生的H＋浓度差推动ATP的生成，同时分解H2O分子产生O2。
6. 脂肪酸的活化在细胞胞液进行，脂肪酰CoA的β氧化在线粒体内进行。
（）答案：正确解析：7. 由于遗传密码的通用性，用原核生物表达真核基因不存在技术障碍。
表达出的蛋白质通常是有功能的。
（）答案：错误解析：8. 糖原中由α1,6糖苷键形成的分支可以增加糖原合成及分解的速率。
（）答案：正确解析：9. DNA的复制过程同时需要DNA聚合酶和RNA聚合酶参与。
（）[浙江大学2010研]答案：正确解析：DNA复制时需要RNA引物，RNA引物由RNA聚合酶合成。
10. 生物体的DNA复制都是双向对称的，没有例外。
（）答案：错误解析：11. 当溶液的pH升高时，ATP水解释放的自由能明显增高。
（）答案：正确12. 当完整环状双螺旋DNA在某一部位分开时，分子的其他部分会引入负的超螺旋。
（）答案：正确解析：13. RNA聚合酶能以两个方向同启动子结合，并启动相邻基因的转录。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1242)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 遗传信息只存在于DNA分子中，一条双链DNA含有许许多多基因，他们是相互不重叠的。
（）[山东大学2016研]答案：错误解析：遗传信息主要存在于DNA分子中，还有少数病毒的遗传信息是存在于RNA分子中，而且一条双链DNA上的基因是可以重叠的，称为重叠基因。
2. 对于反应：ATP＋H2O→ADP＋Pi和ATP＋H2O→AMP＋PPi，其ΔGϴ′是相同的，均为－30.5kJmol。
（）答案：错误解析：反应ATP＋H2O→AMP＋PPi的标准自由能变化∆Gϴ′＝7.7kcalmol＝－32.19kJmol，大于反应ATP＋H2O→ADP＋Pi的ΔGϴ′（即－7.3kcalmol、－30.5kJmol）。
3. 丙酮酸脱氢酶系催化底物脱下的氢，最终交给FAD生成FADH2。
（）答案：错误解析：4. 一个细菌只有一条双链DNA，人的一个染色体含有46条双链DNA。
（）[山东大学2016研]答案：错误解析：人的一个体细胞含有46条双链DNA，一个染色体仅含有1条双链DNA。
5. 密码子的简并性减少了蛋白质突变的频率。
（）答案：正确解析：6. 酰基载体蛋白（ACP）是饱和脂酸碳链延长途径中二碳单位的活化供体。
（）答案：错误解析：线粒体酶系、微粒体酶系与内质网酶系都能使短链饱和脂酸的碳链延长，每次延长两个碳原子。
线粒体酶系延长碳链的碳源是乙酰CoA，微粒体内质网酶系延长碳链的碳源是丙二酸单酰CoA，它们都不用ACP作为酰基载体。
7. RNA病毒因为不含有DNA基因组，所以根据分子生物学中心法则，它必须先进行逆转录，然后才复制和增殖。
（）答案：错误解析：8. 真核生物和原核生物的转录和翻译都是偶联的。
遗传代谢性疾病的基因诊断
公认为国际金标准
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双脱氧链终止法
原理:
测序基础是以ddNTP为 测序反应的链终止剂
掺入到延伸链中的ddNTP 可阻止后续ddNTP或 dNTP的掺入
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示例：BigDye™ Terminators 循环测序反应扩增到未端为BigDye™ Terminators的一
酪氨酸血症III型:对羟苯基丙酮酸双氧化酶缺乏
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基因诊断
酪氨酸血症的基因诊断主要依靠对FAH、HPD和 TAT基因的突变筛选。
研究者已经确认了可导致酪氨酸血症I型的40种FAH突 变，这些突变可导致该酶的不稳定或失活，从而导致使 该酶的活性降低或缺失。
研究者已经确认了10种以上的TAT基因突变，而且，几乎 所有的TAT基因突变可导致酪氨酸血症II型。
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基本流程：第4步
反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发 生降解#43;dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
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基本流程：第5步
加入另一种dNTP，使 第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值
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第二节 遗传代谢性疾病的基因诊断
遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的改变， 从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾
病。
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
二、苯丙酮酸尿症（PKU)
八、家族性高脂蛋白血症
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(483)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 嘧啶核苷酸的补救合成途径需要1磷酸核糖5焦磷酸。
（）答案：错误解析：2. 嘧啶环和嘌呤环在分解代谢中均被水解开环，且降解产物均易溶于水。
（）答案：错误解析：嘧啶环分解过程中开环，降解产物易溶于水。
但嘌呤环不同。
3. 己糖激酶的底物包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖。
（）答案：错误解析：半乳糖不是己糖激酶的底物。
4. DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ都属于多功能酶。
（）答案：错误解析：5. 脂肪酸活化为脂肪酰CoA时，需消耗两个高能磷酸键。
（）答案：正确解析：脂肪酸的活化过程需消耗1molATP，但消耗2个高能磷酸键，也相当于消耗2molATP。
6. 抑制磷酸果糖激酶可导致果糖6磷酸的积累。
（）答案：正确解析：7. 原核细胞中，构成RNA聚合酶的σ因子的浓度低于核心酶的浓度。
（）答案：正确解析：原核细胞RNA聚合酶全酶中的σ因子只参与转录的起始，当起始完成以后即与核心酶解离，并可以重新利用参与新一轮的转录起始，因此它的浓度不需要与核心酶一样。
8. 在丙酮酸经糖异生作用代谢中，不会产生NAD＋。
（）答案：错误解析：9. 葡萄糖6磷酸和果糖6磷酸都是磷酸酯且不含高能键。
（）答案：正确解析：10. DNA分子中没有修饰的C发生自发脱氨基引发突变的可能性比修饰后的5甲基胞嘧啶自发脱氨基引发突变的可能性低得多。
（）答案：正确解析：DNA分子中没有修饰的C发生自发脱氨基后转变为U，很容易被细胞内的BER系统识别和修复。
5甲基胞嘧啶自发脱氨基后转变为T，而T是DNA分子中正常的碱基，不容易被识别和修复，经过一轮复制以后，将导致CG碱基对突变为TA碱基对。
11. 在原核细胞中，mRNA经RNA聚合酶从模板DNA链上转录后都不是成熟的mRNA，要转录加工后才能翻译。
单基因遗传病简介及基因检测
B
A基因和B基因位于同源染色体上相同基因 座位的一对基因，互为等位基因，控制同
一性状，位于一对染色体的同一位置。
是指某种疾病的发生主要受一对等位基因控制，它们的传递方式遵循孟德尔分离律
单基因遗传病
危害性：
致畸、致残、致死，无有效治疗方法
特点：
先天性、终身性、遗传性、临床表型 和遗传异质性
发病率：
单一发病率低，但种类多，总发病率达2.5%。
3. X连锁显性遗传病
• 决定某疾病的基因位于X染色体上，并且此基因对其相应的等位基因来说是显性的，这种遗传病的遗 传方式称为X连锁显性遗传（X-linked dominant inheritance，XD)。
• 男性只有一条X染色体，其X染色体上的的基因在Y染色体上缺少与之对应的等位基因，因此男性只有 成对基因中的一个成员，故称半合子（hemizygote），其X染色体上有此基因就表现出相应性状或疾 病。
1.常染色体显性遗传病
• 遗传病有关的基因位于常染色体上，其性质是显性的，这种遗传方式称为常染色体显性遗传 （autosomal dominant inheritance,AD）。由这种致病基因导致的疾病称为常染色体显性遗传病。
常染色体显性遗传病—特征:
• 发病与性别无关，男女患病几率均等； • 一个致病等位基因即可致病； • 患者双亲之一为患者，同胞中有1/2的可能为患者； • 正常者的后代无患者； • 疾病常存在连续传递现象； • 散在病例源于新产生的突变。
诊断方法
常见基因检测技术：
Lench Nicholas., Barrett Angela., Fielding Sarah., McKay Fiona., Hill Melissa., Jenkins Lucy., White Helen., Chitty Lyn S.(2013). The clinical implementation of noninvasive prenatal diagnosis for single-gene disorders: challenges and progress made. Prenat. Diagn., 33(6), 555-62. doi:10.1002/pd.4124
遗传病的诊断
基因诊断在肿瘤中的作用
肺癌 乳腺癌 结肠癌
四、疾病分子诊断的展望
未来的分子8个细胞期，通过 对其中一个细胞的染色体核型分折和原位 杂交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早 期阶段。 母体外周血中胎儿细胞分析技术。 对常见病、多发病如心血管系统疾病、糖 尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿 瘤、哮喘、近视眼等进行分子诊断。
物理诊断
B超、X线、胎儿镜、电子监护等。
需产前诊断的对象：
夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或 者夫妇染色体正常，但出生过染色体异常的患儿的夫 妇； 35岁以上的高龄孕妇； 夫妇之一有开放性神经管畸形，或出生过这种畸形患 儿的夫妇； 夫妇之一有先天性代谢缺陷，或出生过这种患儿的夫 妇； X连锁遗传病基因携带者孕妇； 原因不明的习惯性流产的孕妇； 羊水过多的孕妇； 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇； 具有遗传病家族史，又系近亲婚配的孕妇。
检测被检DNA中的同源序列。由于探针比 较短，当被检DNA序列与探针不完全互补， 甚至只要有一个碱基的差异，杂交分子就 不能稳定形成，因此该方法的灵敏度非常 高，特异性也非常好。
PCR-ASO
PCR-SSCP
当双链DNA变性为两条单链后，各自 会在中性条件下形成各自特定的空间构象， 因而在电泳时将在不同的位置上出现各自 电泳条带。如果DNA序列发生变化，甚至 只有一个碱基变化，空间构象也有可能发 生变化，电泳条带也随之变化。
PCR-SSCP
三、分子诊断技术的应用
基因诊断在遗传病中的应用
例如：镰状细胞贫血的基因诊断 酶解正常人DNA和患者DNA，用标记的珠蛋 白基因为探针作Southern杂交
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• 例如:
– FVIII基因 ST14(DXS52)位点 (60bp)n – DMD基因intron 44、45、49、50中 (CA)n – PAH基因 intron3中STR(4bp)n
• 优点: 群体中等位基因数目多，杂合子频率高。
第三代遗传标记：单核苷酸多态 （Single nucleotide polymorphism，SNP）
4
5 1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
(3) PCR----DGGE
• 变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE） • Tm值----DNA双链50%解链温度。 • Tm值主要与碱基组成相关。 • PCR扩增后的DNA，在变性梯度由低到高的聚丙 烯酰氨凝胶电泳过程中，Tm值低的DNA片段先 解链，电泳速度变慢 一个碱基差异也能改变 Tm值导致泳动速率改变 产生泳动变位，能检 测已知，未知点突变。 • 检测突变率比PCR-----SSCP高。
DNA自动测序
• 应用如上原理，不同的是：
① 4种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反 应(不用分4个反应体系)。 ② 经过毛细管凝胶电泳分离(不用分4个泳道)。 ③ 激光分析和计算机处理，直接标出碱基序 列。
焦磷酸测序
焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变
下一代 “克隆” 测序
5、DNA微阵列（DNA芯片）
• 生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。 • 肌电图：肌源性改变等。 • 1987年Kunkel等克隆DMD基因，定位于Xp21， 全长2400kb，含79个外显子，cDNA长度为14kb。
• 在杂交测序基础上发展起来的：
① 大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针 有规律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核 苷酸阵列。 ② 将待测的DNA，RNA或cDNA用荧光标记后在 DNA芯片上与探针杂交。
③ 用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算 机处理荧光信号，得出所需信息。
High-resolution melt curve analysis (HRM)
• 基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百 ~1kb之中有一个。
• 应用于：
– 疾病的关联分析
– 基因功能鉴定
– 基因发现和制图
– 候选基因发现
连锁分析举例
I 3
4.2 7.0
I2 4.0 7.0
4.0 7.0
4.0 7.0
4.0 7.0
II 1 4.2 9.7 4.0 7.0 4.2 7.0
PCR Mst II
A … … CC↓TGAGG … … 56 bp 54 bp S … … CCTGTGG … … 110 bp
（2）ASO探针杂交法--检测已知点突变
• 等位特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide probe，ASO）以点突变为中心 合成20bp左右的一对探针：
4、DNA测序
• Sanger法-----双脱氧核苷酸末端终止法。
• 双脱氧核苷酸不能形成5’磷酸和3’OH之间的 磷酸二脂键（因3’也脱氧）而终止反应。
• 4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP， ddTTP，将产生不同长度（在A，G，C，T处随 机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离 呈梯状带型，自下而上是5’ 3’被合成的 DNA链顺序。
检测点突变
• 已知点突变检测：
1、RFLP 2、ASO探针杂交法 3、等位特异性PCR 4、PCR----SSCP
• 未知点突变检测：
1、PCR----SSCP 2、PCR----DGGE 3、DNA测序 4、DHPLC
5、PCR-----DGGE
（1）RFLP方法---检测已知突变
• 基因较大片段缺失或插入 酶切片段长度改变。
第二代遗传标记：数目可变的串联重复 （Variable number tandem repeat，VNTR） • 大约几十bp长的碱基序列在人群中其重复的拷贝 数不同所产生的多态，一般在非编码区中。
– 小卫星DNA(6~28bp)n – 微卫星DNA(2~6bp)n ，也称STRP（small tandem repeat polymorphism）
• 引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长 度。 • 该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷， 目前自动化操作。
PCR扩增
（1）PCR----RFLP
• PCR扩增后酶切，检测点突变或多态。
（2）PCR----SSCP
• 单链构象多态（single strand conformation polymorphism, SSCP）：DNA单链在非变性胶 中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。
• 基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 切点消失或增加 酶切片段长度改变。 酶
• 酶切图谱法检测的缺点:
① 不直接影响酶切点的突变不能检测到。 ② 产生的片段大小太相似也不易被检测到。 • 特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段，再经酶 切后电泳检测----更简便,快速,也能弥补缺点②。
镰状细胞血红蛋白（HbS）
3、PCR技术 （Polymerase chain reaction)
• 1985年美国cetus公司的Kary Mullis创建， 80年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔 化学奖。 • 模拟生物体内的DNA复制，在体外DNA聚 合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。
步骤：
变性
20----30周期 复性 延伸
II 2 4.2 9.7 4.0 7.0
连锁分析的优点
• 不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内 或近旁DNA多态标记就可以分析。
• 缺点:
1、必须要有先证者以及家系中相关各成员的 DNA才能分析。
2、携带者是杂合子时才能分析。 3、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源 染色体交叉互换导致误诊的可能性。
基因诊断
主要内容
一、基因诊断概念 二、基因诊断基本原理及常用技术
1、核酸分子杂交 2、探针标记 3、PCR技术 4、DNA测序 5、DNA微阵列（DNA芯片）
三、基因诊断方法 四、基因诊断-------遗传病产前诊断
一、基因诊断概念
传统诊断法: 表现型 推测 基因型。 基因诊断法: 基因型 推知 表现型。 检测核酸 分析 特定基因 判断 基因型。
• 长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同 构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。 • 能检测已知和未知点突变。
PCR-SSCP过程
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 自显影 ↓ 结果分析
基因诊断特征: 1. 检测DNA不受被检测来源的限制。 2. 症状前诊断成为可能。 3. 对遗传病可进行分子水平再分类----遗传异质性 的分子水平阐明。
二、基因诊断基本原理及常用技术
1、核酸分子杂交
双链DNA
变性 加热,强酸,
单链
复性 探针
杂种DNA
强碱,变性剂
• 探针: 一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列, 作为工作状态的探针必须是单链。 • 常用探针种类: 基因组DNA, cDNA,人工合成的寡 核苷酸。
四、基因诊断-------遗传病产前诊断
1、甲型血友病（Hemophilia A）：FVIII因子遗传 性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病. • 发病率：男性的1/5000~1/10000，XR。 • 症状: – 自然或轻微外伤后出血不止。 – 皮下、关节、肌肉出血----关节强直、劳动力丧 失。 – 颅内出血可危及生命。 • 根据血浆中FⅧ浓度可分为轻、中、重度。
（3）Northern 印迹杂交
• 检测RNA的分子杂交技术
• 提取组织总RNA oligodT mRNA 琼脂糖凝胶电泳分离 转移 含甲醛的 预杂交
探针
杂交
洗膜
放射自显影。
• 检测特异mRNA大小和表达量。
（4）原位杂交及荧光原位杂交
（Flurescence in situ hybridization，FISH）
Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization (CGH)
三、基因诊断方法
1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。 能作直接诊断的条件： 遗传方式已知 病因基因或cDNA已克隆分离 突变性质与疾病关系已阐明 基因突变类型： 1、DNA碱基置换(点突变) 2、DNA片段的缺失、插入、重复等 3、动态突变
核酸分子杂交操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 预杂交 杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
检测杂交信号
（1）斑点杂交 （Dot blotting hybridization）
• 主要用于基因缺失和拷贝数改变。
• 应用： 1）混合样品DNA鉴定 2）基因缺失检测 3）基因表达分析 • ASO探针（等位基因特异性寡核苷酸）---检测已知点突变。
– 与正常序列杂交的探针 – 与异常序列杂交的探针 • 优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变 也能检测。 • 缺点: 突变位点及性质清楚的前提下才能合成 ASO探针，只能检测已知点突变。
2、间接方法---连锁分析法
• 基因内或基因近旁DNA多态为遗传标记进行连锁 分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色 体而作出诊断。
• • • •
染色体标本上，组织切片上分子杂交 原位杂交----3H标记探针 FISH-----荧光素或生物素标记 应用于基因定位，染色体数目及结构异常 诊断。 • 组织切片上的FISH----mRNA水平表达及一 些病原体感染诊断。