第七抗原抗体反应及应用剖析
抗原抗体的反应原理
抗原抗体的反应原理
抗原抗体的反应原理是生物学中的一个核心概念，它涉及到生物体内复杂的免疫应答机制。
简单来说，抗原抗体反应是免疫系统识别和清除外来入侵者（如细菌、病毒等）或体内异常细胞（如癌细胞）的过程。
抗原是一种能刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内或体外发生特异性结合的物质。
它可以是来自外部的微生物（如细菌、病毒）或其产物，也可以是体内自身产生的异常物质（如癌细胞）。
抗原具有特异性，即只能与相应的抗体或淋巴细胞结合。
抗体是由免疫系统产生的，能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白。
当抗原进入人体后，免疫系统会识别并产生相应的抗体。
抗体与抗原的结合是高度特异性的，即一种抗体只能与一种特定的抗原结合。
这种特异性结合是抗原抗体反应的基础。
抗原抗体反应的过程包括两个阶段：首先是抗原与抗体的特异性结合，这是一个快速而可逆的过程；其次是形成的抗原-抗体复合物的进一步处理，如被其他免疫细胞吞噬、降解或进一步激活免疫反应等。
抗原抗体反应的原理在医学上有广泛的应用，如诊断疾病（如免疫检测、抗原检测等）、治疗疾病（如免疫治疗、疫苗接种等）和研究生物学问题（如分子生物学、免疫学等）。
通过深入了解抗原抗体反应的原理，我们可以更好地理解免疫系统的功能和机制，从而为医学研究和应用提供更好的理论基础和实践指导。
图解抗原抗体反应类型和原理课件
形成的沉淀物少，上清液中可测出游离的抗体或抗
原的现象。
➢带现象包前括带(prozone)抗体过量时称为。
后代(postzone）抗原过量时称为。
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四、阶段性
第一阶段：抗原与抗体发生特异性 结合阶段
特点：反应快 第二阶段：反应可见阶段
特点：反应时间较长
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第三节 抗原抗体反应影响因素
注意：解离后的抗原或抗体仍然保持其原有生物活性
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三、比例性（proportionality）
1、比例性是指抗原与抗体发生可见反应 遵循一定的量比关系。 2、以絮状沉淀实验为例，受抗原抗体比 例性的影响非常明显。
3、根据所形成的沉淀物及抗原抗体比例 关系绘制反应曲线。
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教学内容：
第一节 抗原抗体反应的原理 第二节 抗原抗体反应的特点 第三节 影响抗原抗体反应的因素 第四节 免疫学检测技术的类型
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第一节 抗原抗体反应的原理
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一、抗原抗体的亲和力和亲合力
* 亲和力（affinity）：是抗体分 子上一个抗原结合点与相应的抗原决 定簇之间的相适应而结合的强度，是 抗原与抗体间固有的结合力。
2、原因：抗原抗体的结合是分子表面的非共价键 结合，因此形成的复合物不牢固。
3、抗原抗体反应动态平衡式如下：
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4、决定抗原抗体解离的因素
（1）抗体与相应抗原的亲合力。 亲合力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。
（2）环境因素对复合物的影响。 PH过高或过低、增加离子强度均可破坏
抗原抗体反应及应用
Ag Affinity =
Ag attractive and repulsive forces
Calculation of Affinity
Ag + Ab Ag-Ab Applying the Law of Mass Action: [Ag-Ab] [Ag] x [Ab]
Keq =
二、单抗的制备
直接法－抗原包被
Labeled Ab
Ag Tissue Section
间 接 法
Labeled Anti-Ig Unlabeled Ab
Ag Tissue Section
夹 心 法－直 接 夹 心
Labeled Ab Ag in Patient’s sample Immobilized Solid Phase
Back
一、抗血清的制备
1、免疫动物 抗原 佐剂 免疫动物 2、抗血清的纯化与保存 采血 纯化与保存 3、抗血清的鉴定 效价 亲和力
BACK
Affinity
Strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single Ab combining site High Affinity Ab Low Affinity Ab
第四章 抗原抗体反应及应 用
第一节 抗体的制备 抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含 特异性抗体的血清。 多克隆抗体 (PAb)： 多个抗原决定簇免疫机体 所产生的多种抗体的混合物。 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） ： 只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。
Ag Qualitative
–Rapid
+ Ab
抗原抗体反应及应用
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------抗原抗体反应及应用不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。
大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体) ，又有反应原性(与特异的抗体相结合) 。
抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。
一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。
抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为类微量，灵敏，快速的检测分析方法。
本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。
第一节抗体的制备环境中的大部分生物(包括病原生物) 及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。
同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum) ，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同 B 细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonal antibody) 。
一个 B 细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。
1 / 3用免疫动物的 B 细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个 B 细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonal antibody) 。
随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibody combinatorial library) 筛选制备单克隆抗体。
应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineering antibody) ，以及催化性抗体(catalytic antibody 或 abozyme) 等的全新的抗体。
抗原抗体的反应讲解
一、免疫沉淀与免疫凝集
1．溶液中的沉淀反应
在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生 免疫沉淀(immunoprecipitation)反应，表明两者之间有特 异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定 量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和 抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀 试验(ring precipitant test)(图7—l0)。沉淀试验可以在玻璃 管中进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层 轻轻铺上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了 使界面更好地形成，常在下层抗原溶液中加入10％的蔗糖 或甘油。抗原抗体溶液置于37℃或4℃孵育后，在界面上形 成白色沉淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。
5.免疫凝集
颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等）与 抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。
(1)直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集
(2)间接凝集（indirect agglutination） 可溶性抗原或抗体包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相
应 抗体或抗原混合出现的凝集现象。 正向间接凝集试验 反向间接凝集试验 反向间接凝集抑制试验
第七章 抗原抗体反应的应用
免疫沉淀与免疫凝集 免疫标记 免疫定位分析 抗原抗体反应的其他应用
免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对 抗原或抗体进行量或质的测定分析。这类分析方法具 有特异、灵敏和快速的特点，有的可以表现出一个氨 基酸分子的差异，如用单克隆抗体进行检测的方法； 测定的量可以达到μg甚至ng的水平，如ELISA法， 放射免疫法等；反应在几小时，几分钟甚至更短的时 间可以看到测定的结果，如免疫沉淀法等。
免疫学基础：04抗原抗体反应
3.抗血清特性的测定
制备的血清需要对其效价、亲和力以及交叉反应等参 数进行检测。
效价(titer)：在给定条件下反应，以 检测抗血清最大的稀释倍数。
交叉反应：多组分抗原存在共同的决定簇，或者决定簇
类似可以和同一抗体反应。
亲和力(affinity)：抗血清和相应抗原的结合强度。
抗体库技术产生的三项技术基础
RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术（phage display)
噬菌体抗体库 (surface display phage antibody library) 技术：从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取模DNA/RNA，采用
细胞的单克隆化：利用有限稀释法可以将混合 细胞经稀释后分离为单个细胞克隆。培养板的孔 中只出现一个细胞。克隆化重复进行称为亚克隆 化，以保证抗体分泌细胞来源于单个细胞。
3.单克隆抗体的扩大化
杂交瘤细胞扩大培养的方法有三种：小鼠腹水
的制备、大瓶培养和中空纤维反应器。
腹水制备：杂交瘤细胞在腹腔中定植后产生大量的
一、抗血清的制备
1.免疫动物
⑴抗原：病毒、细菌和蛋白质抗原，半抗原必须和
载体连接。抗原的用量视动物而定(μg~mg)。
⑵佐剂：使抗原缓慢释放，增加免疫刺激的效果。
佐剂和抗原1：1混合成乳液。
⑶免疫动物：腹腔、肌肉，皮内和皮下注射适用
于所有的抗原，刺激局部淋巴结发生应答；静脉 注射适合于可溶性抗原和细胞悬液，应答位于脾 脏。
K-
Ka表示抗原抗体复合物的浓度与游离抗原表位的浓度和 游离抗体结合位浓度的比值。又称内在结合常数。 Ka在 107-1012L/mol为高亲和力抗体，低于107时为低亲和力抗 体。
第七章 抗原抗体反应及应用 2011
制备流程
免疫动物 脾脏
B细胞
骨髓瘤细胞培养
骨髓瘤细胞
融合
HAT培养基筛选
阳性克隆 杂交瘤细胞单克隆化
第三节 常见免疫分析方法
抗原抗体反应的种类
• 免疫学技术的发展趋向
• 特异性、敏感性、精密的分辨能力、高水平的定位、试验电脑 化，反应微量化，方法标准化、试剂商品化、方法简便快速。 • 用单克隆抗体提高特异性；用各种标记技术提高敏感性；结合 各种电泳技术提高对抗原分析的分辨能力，结合激光共聚焦显 微镜、电子显微镜进行亚细胞水平、染色体、甚至分子水平上 的定位；放射免疫测定、免疫酶标抗体测定，在专门仪器上配 备有电脑和分析软件，使试验操作和试验结果处理和记录自动 化；以免疫学技术为基础的蛋白质芯片技术，使血清学检测技 术向更加微量化、自动化和规模化集成方向发展。利用基因工 程重组抗原和单克隆抗体研制各种诊断试剂盒和试剂纸条，其 中备有各种标准抗原和参考血清，使其标准化和商品化，是血 清学试验的一个重要发展趋向，将大大促进血清学技术的普及 和应用。
DAB
固相 酶
联苯二胺
抗体包被
待测Ag 已知Ag 产物
DAB
固相 酶
抗原包被
（2）间接法
是将酶标记在第二抗体上，当抗原与第一抗 体结合后，再用酶标第二抗体来检查第一抗 体是否与抗原结合。有酶底物显色的反应为 正反应，反之为负反应 .
原理为利 用酶标记 的抗抗体 检测受检
抗体。
（3）夹心法
第一抗体
抗原抗体反应的原理及特点应用
抗原抗体反应的原理及特点应用1. 原理抗原抗体反应是免疫系统中关键的免疫识别过程。
抗原是一种能够激发免疫系统产生抗体或细胞免疫应答的物质。
抗体是由免疫细胞（主要是B细胞）产生的蛋白质分子，可以识别和结合特定的抗原。
抗原抗体反应在生物学研究、免疫诊断和免疫治疗等领域都有重要的应用。
1.1 抗原的特点•多样性：抗原可以是多种化学性质的物质，如蛋白质、多糖、脂质和核酸等。
不同抗原之间的结构和性质都有所差异。
•特异性：抗原可以与相应的抗体发生特异性反应，即抗体只能识别并结合特定的抗原。
•免疫原性：抗原具有诱导机体免疫应答的能力。
免疫原性主要与抗原的分子大小、复杂性和非自身特性相关。
1.2 抗体的特点•多样性：抗体由许多不同类型的基因编码，因此可以产生大量多样性的抗体。
•结构复杂：抗体由两个重链和两个轻链组成，形成Y字型的结构。
其中抗原结合位点位于抗体的顶端。
•亲和力：抗体与抗原结合的亲和力通常很高，可以形成稳定的抗原-抗体复合物。
•特异性：抗体可以特异性地识别和结合特定的抗原分子。
2. 应用2.1 免疫诊断抗原抗体反应在临床诊断中有广泛的应用。
通过检测特定抗体与抗原的结合情况，可以获得有关某种疾病或病原体感染的信息。
目前常用的免疫诊断方法包括免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫测定法等。
•免疫荧光：该方法通过检测标记在抗体上的荧光染料来判断是否与特定抗原结合。
常用于检测自身抗体、病原微生物和病毒等。
•ELISA：ELISA是一种基于酶标记物的免疫分析技术。
通过测定酶与底物之间的反应来检测抗原和抗体的结合。
常用于癌症、传染病和药物检测等领域。
•放射免疫测定法：该方法利用放射性同位素标记的抗体来检测抗原和抗体的结合。
常用于检测激素、肿瘤标志物和传染病等。
2.2 免疫治疗抗原抗体反应在免疫治疗中也有重要的应用。
通过向机体内部引入特定抗原或抗体，可以调节免疫系统的功能，以达到治疗疾病的目的。
•疫苗免疫：疫苗是通过免疫接种引入特定抗原，激发机体产生特异性抗体和免疫记忆，以预防或治疗疾病的方法。
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[Ag-Ab] Keq = [Ag] . [Ab]
• Reversible
亲合力（Avidity）p156
❖ 多价抗原与抗体结合强度的总体评价 ，反映抗原抗体 结合的总体效果。（提高浓度改善抗原抗体亲和性）
If each antigen molecule contains only a single epitope recognized by a given monoclonal antibody, the antibody can link only two molecules of antigen and no precipitate is formed.
一、抗血清的制备
1、免疫动物 抗原 — 佐剂 — 免疫动物
2、抗血清的纯化和保存 采血 — 抗血清的纯化—保存
3、抗血清的特性鉴定 滴度（titer） —亲和（合）力— 特异性
二、抗体的特性
1 抗原-抗体反5/chime2/lyso-abfr.htm
– 氢键 – 离子键 – 范德华力 – 疏水键
Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000
2 抗体的特性测定
❖ 滴度（Titer）是指在给定条件下，结合一定量抗原 所需的最大的抗血清稀释倍数。（因方法不同有差 异）
Ag A
Ag B
AAgg CC
Shared epitope
SSiimmiillaarr eeppiittooppee
第三节 常见免疫分析方法
❖ 利用抗原抗体特异性反应特点，对其中之一进行 定性定量分析的方法。
❖ 特异、灵敏、迅速特点。 一、免疫沉淀（immune precipitation)
沉淀反应：
抗原决定簇（表位）-多价抗原-表位重叠
❖ 半抗原为单抗原决定簇 ❖ 结合在固体上具有多抗原决定簇的效果 ❖ 与液体中的半抗原反应不同 2 抗原抗体的亲和力和亲合力 ❖ 亲和力(affinity)单价抗原与抗体结合的强弱 ❖ 亲合力(avidity) 多价抗原与抗体结合强度的总体评价 3 抗体与多价抗原结合的浓度带现象 ❖ 抗体与单价抗原结合往往形成可溶性复合物
Keq
104
=
Affinity
106 Avidity
1010 Avidity
3 影响抗原-抗体反应的因素
❖ 亲和力 ❖ 亲合力 ❖ 抗原抗体比例
❖ 抗原的物质形式 ❖ 环境条件
温度、离子浓度等
Ab excess
Ag excess
Equivalence – Lattice formation
Polyclonal antibodies can form lattices, or large aggregates, that precipitate out of solution.
- precipitation is inhibited
and antibody not bound to
antigen can be detected in
the supernatant;
an equivalence zone of maximal precipitation --antibody and antigen form large insoluble complexes and neither antibody nor antigen can be detected in the supernatant;
❖ 特异性（Specificity） 特异性检测/竞争性检测
❖ 亲和力（Affinity）和亲合力（Avidity）
亲和力是单个抗原表位与单个抗体结合位点 之间的作用力，反映抗体与抗原表位特异性结合 强弱的量化指标。
High Affinity
Low Affinity
Ab
Ab
Ag
Ag
Calculation of Affinity
可溶性抗原（血清蛋白、细胞裂解液等）与相应抗 体结合后，在有电解质存在时，比例适当，出现肉眼可 见的沉淀物。
半固体琼脂凝胶为介质。
•Precipitation reactions（沉淀反应）（soluble)
in fluids yield a precipitin curve
A zone of antibody excess--
抗体与同源抗原反应，又与异源抗原结合就 产生了交叉反应。同源抗原结合强，异源结合弱。
交叉反应
•
单个抗体结合位点能与不同的抗原表位发生反
应或者一个抗体能与不同的抗原反应。
•
当抗原具有相同或相似的抗原表位时即可发生
交叉反应。
Cross reactions
Anti-A Ab
Anti-A Ab
AAnnttii--AA AAbb
第七章 抗原抗体反应及应用
第一节 抗体的制备
❖ 多抗（ployclonal antibody） ❖ 单抗（monoclonal atibody） ❖ 抗体库（antibody library） ❖ 基因工程抗体（engineering antibody） ❖ 催化抗体（catalytic antibody or abozyme） 抗血清：含有特异性抗体的动物血清。
❖ 抗体与多价抗原可以形成沉淀（条件） 抗原抗体反应时 前带区（抗体过量，沉淀少） 等带区（抗体抗原适量，大量沉淀） 后带区（抗原过量，沉淀少） 初级反应（未出现沉淀） 次级反应（出现沉淀）
❖ 形成沉淀需要一定时间，另外温度、pH值、离子 强度、补体等
❖ 沉淀的形成可以用网络理论解释
4 交叉反应
第二节 抗原抗体反应原理
抗原抗体反应是非共价的特异性可逆反应。
体外免疫检测的原理。
一、抗原抗体反应的热力学与动力学
1 溶液中抗原抗体反应的化学平衡
Ag+Ab=Ag-Ab
Kα = [SL] /[S][L]= K+/K-
p152
Kα : 平衡常数或内在亲和力。Kd:解离常数
抗体结合抗原的特异性
❖ 同源抗原（强） ❖ 异源抗原（弱） ❖ 变态抗体（强） ❖ 抗原末端或表面基团具有免疫优势 三、抗体与大分子多价抗原的反应 1 多抗原决定簇-大分子抗原特征