如何构建质粒克隆
抗体质粒构建
抗体质粒构建一、概述抗体质粒构建是一种常用的实验技术，用于合成抗体或进行蛋白质的表达。
本文将详细介绍抗体质粒构建的原理、步骤和常见技术。
二、抗体质粒构建的原理抗体质粒构建是通过将目标抗体的基因序列插入质粒中，利用细菌进行大规模复制，从而合成大量的目标抗体。
其原理主要包括以下几个方面：2.1 抗体基因的选择在抗体质粒构建中，首先需要选择目标抗体的基因序列。
这可以通过从已知的抗体基因库中提取目标基因，或者通过克隆和PCR等技术从细胞中提取基因。
2.2 质粒的选择质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中进行复制。
在抗体质粒构建中，选择合适的质粒非常重要。
常用的质粒包括pUC19、pET等，其选择取决于实验需求和目标抗体的表达系统。
2.3 DNA片段的插入将目标抗体基因序列与质粒进行连接是抗体质粒构建的关键步骤。
这可以通过限制性内切酶切割质粒和目标基因，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
2.4 质粒的转化将连接好的质粒转化到细菌中是进行大规模抗体表达的关键步骤。
这可以通过电穿孔、热激转化或化学转化等方法实现。
三、抗体质粒构建的步骤抗体质粒构建通常包括以下几个步骤：3.1 DNA片段的扩增首先，需要通过PCR等方法扩增目标抗体基因的DNA片段。
这可以通过设计引物、选择合适的反应条件和优化PCR反应体系来实现。
3.2 质粒的准备同时，需要准备合适的质粒。
这包括从细菌中提取质粒、线性化质粒和进行酶切等处理。
3.3 DNA片段的连接将目标抗体基因的DNA片段与质粒进行连接。
这可以通过DNA连接酶和连接缓冲液等试剂进行反应，最终得到连接好的质粒。
3.4 质粒的转化和筛选将连接好的质粒转化到细菌中，并进行筛选。
这可以通过培养转化细菌、利用抗生素选择和进行PCR检测等方法实现。
3.5 抗体的表达和纯化最后，利用适当的表达系统，将抗体在细菌中进行表达，并通过亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化。
四、抗体质粒构建的常见技术抗体质粒构建涉及到多种实验技术，下面介绍其中几种常见的技术：4.1 PCRPCR是一种通过体外扩增DNA片段的技术，广泛应用于抗体质粒构建中。
car质粒构建的原理
car质粒构建的原理车质粒构建的原理车质粒构建是一种常用的分子生物学技术，用于将感兴趣的基因片段插入到质粒中，以便在细胞中表达该基因。
质粒是一种环状的DNA分子，常见于细菌中，可以独立于细菌的染色体存在。
在车质粒构建中，质粒通常被用作载体，将目标基因片段插入质粒的多克隆位点中，然后将质粒转化到细菌中进行扩增和表达。
车质粒构建的原理可以分为以下几个步骤：1. 选择适当的质粒载体：质粒载体的选择应根据实验的需求而定。
一般而言，质粒载体应具有适当的多克隆位点，能够容纳目标基因的大小，并且能够在目标细胞中稳定复制和表达。
2. 准备目标基因片段：目标基因片段可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割或合成的方式获得。
在PCR扩增时，需要设计引物，使其能够特异性地扩增目标基因片段。
在限制性内切酶切割时，需要选择适当的酶切位点，使其能够切割目标基因的两侧，以便将其插入到质粒的多克隆位点中。
3. 酶切与连接：将目标基因片段与质粒载体进行酶切，以生成互补的粘性末端。
然后，将目标基因片段与质粒进行连接。
连接过程中，需要使用DNA连接酶来催化连接反应。
连接完成后，将得到的重组质粒转化到适当的宿主细胞中。
4. 转化与筛选：将重组质粒转化到细菌中，使其能够在细菌中复制和表达。
转化的方法可以是热激转化、电穿孔法或化学法等。
转化后，将转化细菌分散于含有抗生素的琼脂平板上，以筛选带有目标基因的细菌克隆。
抗生素通常与质粒上的抗生素抗性基因关联，只有带有重组质粒的细菌能够在抗生素的选择压下生长。
5. 验证重组质粒：通过PCR、酶切、测序等方法验证重组质粒中是否成功插入了目标基因。
这些验证方法可以确保质粒中的目标基因完整、准确，并且能够被正常地表达。
总结起来，车质粒构建是一种将目标基因片段插入质粒载体中的技术。
通过选择适当的质粒载体、准备目标基因片段、酶切与连接、转化与筛选以及验证重组质粒，可以获得带有目标基因的质粒，用于进一步的表达和功能研究。
两大方法帮你搞定质粒构建
两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。
下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。
壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。
1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
[可选酶切体系]VECTOR 3 ugCutSmart Buffer 5 ul限制性内切酶 1 1 ul限制性内切酶 2 1 ul酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。
每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切后载体通过切胶回收线性化载体。
2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端（2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段[可选 PCR 扩增体系]ddH2O：14ul10xTaq buffer：2ul10um DNTP：1ul10um primer F：0.5ul10um primer R：0.5ul模板 DNA：1ulTaq 酶：1ul[可选 PCR 扩增条件](1)95℃：5min(2) 35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根据引物TM值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程
1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)
2.回收
回收（碱裂解法提取质粒DNA)
6．重组质粒克隆的鉴定
1）通过PCR方法鉴定：以重组质粒为模板，PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。
2）酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了
7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定
8.浓度测定仪及琼脂糖凝胶检测
质粒构建从入门到精通
质粒构建从入门到精通今天我们就来说说质粒构建——一名合格「快递员」的养成记。
质粒构建的原理外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。
经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。
质粒构建流程示意图质粒构建的步骤「快递」目标片段的过程主要有三个步骤：▼▼▼01PCR 扩增「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。
PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。
PCR 的最大特点是能将微量的DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。
PCR 扩增简要步骤：利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
Tips▼扩增过程中的关键点▼QPCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。
答案点击下方空白处获得答案A：通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。
此外引物设计的好坏是关键。
除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。
常规引物设计原则1.引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。
2.引物 Tm 值最好在60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过5°C。
3.GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。
4.引物自身不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。
5.引物之间不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。
6.3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。
质粒构建步骤
质粒构建步骤
嘿，你问质粒构建步骤啊？这事儿还挺复杂，不过咱慢慢说。
第一步呢，得先确定你要构建啥样的质粒。
就像你要盖房子，得先有个设计图吧。
想好你要把哪些基因放进去，要让质粒有啥功能。
这可不能瞎整，得有个明确的目标。
第二步，准备材料。
你得有合适的载体质粒，就像盖房子得有块地一样。
还有你要插进去的基因片段，这就好比盖房子的砖头瓦块啥的。
还得有各种酶啊，像剪刀一样把东西剪开再拼起来。
第三步，把基因片段剪下来。
用特定的酶在合适的位置把基因片段从原来的地方切下来。
这就像用剪刀把一块布剪成你想要的形状。
得小心点，可别剪坏了。
第四步，把基因片段插进载体质粒里。
这就像把一块拼图放进一个大拼图里一样。
用另一种酶把载体质粒打开一个口子，然后把基因片段塞进去。
再把口子封上，让它们连在一起。
第五步，验证一下你构建的质粒对不对。
可以用一些方法，比如测序啊，看看基因片段是不是插对地方了，有没有弄错啥的。
要是不对，就得重新来过。
比如说有个科学家想构建一个能让细菌发光的质粒。
他先想好要把哪个发光基因插进去，找好了载体质粒和各种酶。
然后小心翼翼地把发光基因剪下来，插进载体质粒里。
最后验证的时候发现插对了，可高兴了。
把这个质粒放到细菌里，细菌就真的发光了。
所以说啊，质粒构建可不是件容易的事，得一步一步来，细心又耐心。
咋样，现在知道质粒构建的步骤了吧？。
质粒的构建
质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。
质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。
1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。
1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。
通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。
二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。
基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。
2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。
通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。
常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。
2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。
连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。
2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。
通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。
三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。
通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。
3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。
通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。
下面将介绍构建质粒的步骤。
1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。
质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。
常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。
选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。
2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。
获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。
3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。
确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。
4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。
连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。
常用的转化方法有热激转化、电击转化等。
转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。
7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。
培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。
8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。
提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。
通过以上步骤，就可以成功构建质粒。
构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。
同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
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Phusion超保真PCR试剂盒 Phusion超保真PCR试剂盒 超保真PCR
第三步： 第三步：双酶切载体
EcoRⅠ Ⅰ Buffer3 : 2ul vector: 4ul 100%BSA: 0.2ul EcoR Ⅰ: 1ul BglⅡ: 2ul ddH2O: 10.8ul 20ul
BglⅡ Ⅱ
荧光表达在前时(EGFP) 荧光表达在前时
• Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG
• Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG
• 因TGA为终止密码子，所以之后的移码不需理ห้องสมุดไป่ตู้ 为终止密码子， 为终止密码子
荧光表达在后时 (DsRed)
第一步： 第一步： 设计目的基因PCR PCR引物 设计目的基因PCR引物 目的： 目的：
1）通过PCR方法扩增目的基因 通过PCR方法扩增目的基因 PCR 2）在目的基因片断两端增加酶加位点
★酶切位点旁需加入保护碱基
设计引物前需解决的问题
♣ 1、选择酶切位点 ♣ 2、选择保护碱基 ♣ 3、终止密码子
第八步： 第八步：验证 (2)
• 双酶切 (EcoRⅠ, BglⅡ)
Buffer3 : 2ul template: 5ul 100%BSA: 0.2ul EcoR Ⅰ: 0.5ul BglⅡ : 1ul ddH2O: 11.3ul 20ul 37℃ 3h
Positive: 2,7,9,10 Loading volume: 10ul
构建过程
增加酶切位点, ★ 设计引物 (增加酶切位点, BglⅡ, EcoRⅠ) • • • • • • • • 目的基因PCR 目的基因PCR 双酶切载体 (BglⅡ, EcoRⅠ) 琼脂糖凝胶电泳 载体) DNA 胶回收 ( 基因 ,载体) 双酶切目的基因 (BglⅡ, EcoRⅠ) 目的基因与载体相连 DH5α转化 DH5α转化 鉴定
*
enzyme Sal Ⅰ XhoⅠ EcoR Ⅰ BamHⅠ Bgl Ⅱ PstⅠ BclⅠ
*
BAX 0 1 0 1 0 0 0 3 2,3,4 1,2,3,4 buffer
DNAStar软件 - MapDraw功能 软件 功能
AGATCT ---- BglⅡ GAATTC ----EcoR I
第二步：PCR目的基因 第二步：PCR目的基因
33.5 uL dH2O 10 uL phusion HF buffer 1 uL dNTP(10mM) 2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO 0.5uL phusion polymerase 50 uL 1. 98℃(1min) 2. 98℃ (5s) 3. 65 (20s) 65℃(20s) 4. 72℃(20s) 5. back to step 2 for 25 times 6. 72℃ (10min) 7. 18℃ for ever
• Primer2
CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg
• KOZAK 序列: gccacc, 加在起始密码子之前 序列:
Primer final
• Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGA GCAG • Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCA GATGGTG
EcoRⅠ
Bax pCMV-Sport 6
MCS 多克隆位点
缺点： 缺点：
无荧光：GFP、Dsred 无荧光：GFP、 无标签: 无标签 Flag、 HA、 Myc 、 、
pCMVSPORT6 MCS
Gene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562 Insert site：EcoRI, XhoI ：
T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax : 6ul vector : 1ul ddH2O: 10ul (2)
X
4/1~10/1
T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax: 3ul vector: 1ul ddH2O: 13ul (1)
PEGFP MCS
▲ ▲ ▲ ▲ ▲
选择酶切插入位点： 选择酶切插入位点：
1、两个酶切位点间隔 、 远 2、目的基因序列中无 、 相应酶切位点 3、酶切缓冲液一致 、
BAX insert sequence
• atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctct gagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcg agcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggt gcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcg gggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt • gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctg acatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctacttt gccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatc agaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggct ggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcc cacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactc accatctggaagaagatgggctga
5kb 2.5kb
目的基因
载体
第五步： 第五步：双酶切及回收目的基因
Buffer3 : 2ul BAX: 15ul 100%BSA: 0.2ul EcoR Ⅰ: 0.5ul BglⅡ: 1ul ddH2O: 1.3ul 20ul
37℃ 4h
TAKARA片断回收试剂盒 TAKARA片断回收试剂盒
第六步： 第六步：回收效率验证
37℃ 4h
第四步：琼脂糖凝胶电泳、 第四步：琼脂糖凝胶电泳、 凝胶回收
• • • • 0.6% gel 6* loading buffer 50ul sample 80V
琼脂糖浓度% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 DNA分离范围 5～60 1～20 ～ 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～3
From left to right: Marker: 15000bp EGFP BAX restriction BAX PCR Marker:100bp
5kb 2.5kb
Loading volume: 5ul
第六步： 第六步：连接
载体100ng: 载体100ng: 目的基因的量为: 目的基因的量为: 100x目的基因分子量 100x目的基因分子量 载体分子量
如何构建质粒克隆
周鸿雁 2011.06.15
连接Bax基因至EGFP载体 思路 连接Bax基因至EGFP载体 Bax基因至EGFP
加入 BglⅡ 酶切位点 EcoRⅠ酶切位点 加入 EcoRⅠ酶切位点
Bax pCMV-Sport 6
连接 ↑ 酶切 ↑ 目的基因 两侧加入 酶切位点
目的基因
BglⅡ
目的载体
5软件 设计引物 Primer 5软件
• cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc
Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length ---21, GC%---71.8%, Tm---71.4)
• ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag
Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length ---25, GC%---52%, Tm---68.4)
引物中是否应包含终止密码子？ 引物中是否应包含终止密码子？
MCS在EGFP之后表 MCS在EGFP之后表 达，需加终止密码子
MCS在DsRed之前表达， MCS在DsRed之前表达， 之前表达 不可以加终止密码子
protection seqence: GGAAGATCTTCC CCGGAATTCCGG
切割率 2h=25%, 20h>90% 2h>90%, 20h>90%
提高酶切活性、增加酶切效率、 提高酶切活性、增加酶切效率、缩短酶切时间
设计引物原则
引物的长度一般为15 bp，常用的是18 bp， 15181. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp， 引物序列的GC含量一般为40引物序列的GC含量一般为40-60% GC含量一般为40 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃ Tm值在72℃左右可使复 2. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复 性条件最佳 3. 避免引物二聚体及发夹结构 4. 引物的特异性 5. 碱基随机分布
第八步： 第八步：验证 (3)
谢谢，敬请批评指正！ 谢谢，敬请批评指正！
克隆连接
平端连接 难连接
粘端连接 易连接
T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax : 10ul vector : 1ul ddH2O: 6ul (3)
16℃ 过夜 ℃
第七步： 第七步：转化
• 100ul DH5α + 20ul 连接产物
第八步： 第八步：验证 (1)