在流式细胞仪上可清楚地将淋巴
实验七 流式细胞仪检测技术
实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对单个细胞进行快速、高效的分析和排序。
流式细胞仪的工作原理是利用激光照射细胞，测量细胞在流动状态下的荧光和散射信号，从而获取细胞的多种特征信息。
本文将详细介绍流式细胞仪的工作原理，以及其在生物医学研究中的应用。
首先，流式细胞仪的工作原理基于细胞在流动状态下对激光的反射和荧光发射。
当细胞悬浮在流体中通过激光束时，细胞会散射激光光线并发出荧光信号。
流式细胞仪通过收集这些散射光和荧光光信号，并对其进行检测和分析，从而获得细胞的多种信息，如大小、形状、表面标记物、细胞器的含量等。
其次，流式细胞仪的核心部件包括激光系统、光学系统、流体系统和信号检测系统。
激光系统用于产生激光束，不同波长的激光可用于激发不同荧光染料；光学系统用于聚焦激光束和收集散射光和荧光光信号；流体系统用于将细胞悬浮液以单个细胞的方式输送到激光束中；信号检测系统则用于检测和记录细胞发射的光信号。
这些部件协同工作，使得流式细胞仪能够高效地对细胞进行分析和排序。
流式细胞仪在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于表征和分析不同类型的细胞。
通过对细胞的大小、形状、表面标记物等特征进行分析，可以帮助科研人员更好地了解细胞的功能和特性。
其次，流式细胞仪还可以用于细胞的分选和分离。
科研人员可以根据细胞的特征，利用流式细胞仪将不同类型的细胞进行分选和分离，从而获得纯度较高的细胞群。
此外，流式细胞仪还可以用于检测和分析细胞内的蛋白质、核酸和其他生物分子，对于疾病诊断、药物筛选等方面有着重要的应用价值。
总之，流式细胞仪通过激光照射细胞，测量细胞在流动状态下的荧光和散射信号，从而获取细胞的多种特征信息。
它在生物医学研究中有着广泛的应用，可以帮助科研人员更好地了解细胞的特性，进行细胞的分选和分离，以及分析细胞内的生物分子。
随着技术的不断进步，流式细胞仪将在生物医学研究领域发挥越来越重要的作用。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种用于分析和计数细胞的仪器，它能够快速、高效地获取细胞的多个参数信息。
它在生物医学研究、临床诊断和药物开辟等领域发挥着重要作用。
本文将详细介绍流式细胞仪的工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统包括激光器、光学镜头、滤光片和探测器等。
激光器产生高强度的单色激光束，经过光学镜头聚焦后，照射到待测样品上。
样品中的细胞或者颗粒吸收、散射或者荧光发射部份光线，这些光线经过滤光片进行分光，然后由探测器接收和记录。
2. 流体系统流式细胞仪的流体系统由进样系统和废液系统组成。
进样系统通过注射器将待测样品引入流式细胞仪，样品通过细胞管道以恒定的速度流动。
废液系统则将已经分析过的样品排出。
3. 细胞检测和分析当待测样品流经流式细胞仪时，激光束照射到细胞或者颗粒上，细胞或者颗粒会发生散射和荧光现象。
流式细胞仪通过不同的探测器来检测不同的光信号。
常用的探测器有前向散射探测器、侧向散射探测器和荧光探测器等。
- 前向散射探测器：用于测量细胞或者颗粒的大小和形状。
较大的细胞或者颗粒会散射更多的光线。
- 侧向散射探测器：用于测量细胞或者颗粒的复杂性和内部结构。
散射角度越大，表示细胞或者颗粒越复杂。
- 荧光探测器：用于测量细胞或者颗粒的荧光信号。
通过标记细胞或者颗粒上的特定份子，可以检测其荧光强度。
4. 数据采集和分析流式细胞仪通过计算机系统对检测到的光信号进行数据采集和分析。
计算机软件可以对细胞或者颗粒进行分类、计数和分析。
常见的分析参数包括细胞大小、形状、复杂性、荧光强度等。
5. 应用领域流式细胞仪在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
在免疫学研究中，流式细胞仪可以用于检测和鉴定不同类型的免疫细胞，如淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等。
在肿瘤学研究中，流式细胞仪可以用于检测肿瘤细胞的生长状态和表面标记物。
在临床诊断中，流式细胞仪可以用于血液学、免疫学和遗传学等方面的检测。
总结：流式细胞仪通过光学系统、流体系统和数据采集与分析系统实现对细胞或者颗粒的检测和分析。
流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用
流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。
随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。
本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。
关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。
其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。
近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。
流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。
随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。
1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。
流式细胞仪的三大应用范围
2，白血病的免疫分型：
白血病免疫学分型是利用单克隆抗体 (McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细 胞浆抗原（CD）,分析其表现型,以了解被 测白血病细胞所属细胞系列（如髓系、 红系、淋巴系等白血病亚型）及其分化 程度。对白血病细胞抗原的分析研究有 助于对白血病分型，为诊断和治疗提供 依据。
举例：T系急性淋巴细胞白血病免疫表 型特点（T-ALL）： 根据T淋巴细胞在胸腺内的成熟顺序， 将T-ALL分为早期、中期和晚期三类。 早期T-ALL：表达CD7和CD1a，CD4、 CD8膜CD3均为阴性；中期T-ALL：除 表达CD7和CD1a外，还表达CD2、 CD5，CD4/CD8同时表达，膜CD3仍为 阴性；晚期T-ALL：膜CD3为阳性，但 丢掉CD1a，其他标志同中期。通过检测 CD抗原来确定白血病分期。
流式细胞仪的主要应用范围
• 1，流式细胞仪的免疫荧光检测； • 2，流式细胞仪的细胞周期检测； • 3，流式细胞仪的细胞分选；
（一）在免疫学中的应用 ----重要的免疫学实验技术
• 抗原(antigen，Ag)是指能刺激机体 免疫系统诱导免疫应答并能与应答 产生如抗体或致敏淋巴细胞发生特 异反应的物质。 • 抗原多为相对分子质量在10,000以上 的蛋白质和多糖大分子.
File: 2006/9/20 Yang.002 Acquisition Date: 19-Sep-06 Quad Events % Gated % Total X UL 2 0.03 0.02 UR 121 1.57 1.21 LL 5939 77.05 59.39 1646 21.35 16.46 LR
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流式淋巴细胞亚群检测技术原理
荧光染料标记法
荧光染料的选择
根据抗原特异性选择相应的荧光染料，如异硫氰酸荧光素 （FITC）、藻红蛋白（PE）等。
标记过程
将荧光染料与特异性抗体结合，形成荧光标记的抗体，再 与待检测的淋巴细胞样本反应，使抗原抗体结合，形成荧 光标记的淋巴细胞亚群。
检测结果
通过流式细胞仪检测荧光信号，实现对淋巴细胞亚群的定 性和定量分析。
数据分析
使用专业软件对原始数据进行分析，包括细胞亚群的识别、计数和比 例计算等。根据实验结果，可以对患者的免疫状态进行评估和诊断。
05 流式淋巴细胞亚群检测技 术应用领域
免疫学领域应用
免疫细胞分型
利用流式细胞术对淋巴细胞进行分型，研究不 同亚群的免疫学特性。
免疫细胞功能研究
通过检测淋巴细胞亚群的表面标志物和胞内因 子，研究其在免疫反应中的功能。
喷嘴和流动室
喷嘴是连接样品管和流动室的通道， 它的直径通常很小，以便形成高速流 动的细胞悬液。流动室是检测细胞的 场所，它通常是一个透明的石英玻璃 管，内部充满鞘液。当细胞悬液通过 喷嘴进入流动室时，它们会被鞘液包 裹并排列成单行，以便后续的光学检 测。
信号检测与处理
信号检测
在流式细胞术中，信号检测通常包括前向散射光、侧向散射光和荧光信号的检测。前向散射光与细胞的大小和折 射率有关，侧向散射光与细胞的内部结构和颗粒度有关，而荧光信号则与细胞内特定成分的含量和性质有关。这 些信号可以通过光电倍增管等光电转换器件转换为电信号进行后续处理。
数据处理软件介绍及操作指南
01
FlowJo软件
功能强大的流式数据分析软件，支持多种格式数据导入和导出，提供丰
富的数据处理和分析工具。
02
Cytobank平台
淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式是一种通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群的方法。
流式细胞术是一种用于分析细胞特性和功能的生物技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面和内部标记物进行定量和定性分析。
在淋巴细胞亚群流式中，通过使用特异性抗体标记不同的淋巴细胞亚群，如T细胞、B细胞、NK细胞等，然后利用流式细胞仪对标记后的细胞进行快速分析和计数。
这种方法可以获得淋巴细胞亚群的相对百分比和绝对值，从而评估机体的免疫状态。
淋巴细胞亚群流式在临床诊治中发挥了重要作用。
例如，在白血病诊断和治疗中，通过监测异常淋巴细胞亚群及绝对计数结果，可以为临床初步判断信息提供依据。
同时，在诊疗阶段，更为明确的白血病分型及MRD监测有助于为治疗方案选择、临床疗效分析、预后判断、复发监测等方面提供更加精准的医学决策支持。
此外，在免疫重建过程中，多参数流式细胞术结果对于及时评价患者的细胞免疫功能，指导免疫抑制剂等药品的使用种类和剂量等方面均具有重要价值。
需要注意的是，临床检测都有标准化的检测方案，可以直接上机调用建立好的内置模板，使用比较方便。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理及注意事项
流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。
在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。
其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。
**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。
通常情况下，我们会收集外周血进行检测。
在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。
2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。
我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。
这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。
3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。
在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。
4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。
**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。
通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。
2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。
还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。
3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。
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其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。
制备大鼠肾脏浸润细胞
材料： 解剖刀、CO2孵育箱、滤网
以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）
方
法：
1. 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块； 2. 加入10ml胶原酶溶液，37º C CO2培养箱孵育30分钟； 3. 滤网过滤； 4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。
颗粒以衡定的速度作匀速运动。
无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的
流式细胞仪标本准备
染色的一般原则及方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。
可用的抗凝剂如下：
EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
其他类型细胞
在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不 同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消 化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、 鼠上皮细胞。
材
1. 解剖刀
料
2. 0.15%胰蛋白酶
3. Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.3 4. 不含Ca、Mg离子的HBSS 5. II型胶原酶 6. 1%BSA或5%FBS
富集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育10分钟；
4. 4º C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；
5. 4º C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；
6. 4º C，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
细胞培养
许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细 胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。
准备单细胞悬液
1.仪器和试剂： 0.25%r EDTA,pH 7.2
0.25% 的胰酶
10%血清的培养液 2.方法：
a. PBS洗涤细胞；
b. 加入0.25%有胰酶，37º C处理2~8分钟； c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。
3. 分装后-20º C保存
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸
为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD 公司的FACSLyse溶血剂。
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地
将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。
缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，
随时间Байду номын сангаас胞形态变化大。
d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml 的细胞悬液。
样本处理
抗体染色一般方法
目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml
• 外周血白细胞分析：100ul全血
• 血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量）
• 红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使 用） • 骨髓：100ul • 其他样本，计数后决定使用体积
7. 5ml的吸样管
8. 35um尼龙滤网 9. DNase
操
作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切
成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS；
4. 37º C摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
方法二：密度离心法提取单个核细胞
Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠)
混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆
层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。
从组织获取淋巴细胞
淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松
散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤 便可。
方 法：
1. 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 2. 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离； 3. 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。
标本处理时间：
新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析
样本固定方法：
1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。
样本处理标准试剂：
一、10%Bovine Serum Albumin BSA
1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中 2. 4º C，20000 g离心30分钟
5. 用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液；
6. 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；
7. 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后
仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；
8. 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS 重悬， 37º C孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭 活酶活性。
操 作
1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释； 2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma)； 3. 室温下700g离心30分钟； 4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；
5. 加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟；
6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。
流式细胞仪原理介绍
流式细胞仪标本处理一般原则及方法
流式细胞仪使用一般方法及技巧 临床流式细胞仪应用简介
殷跃锋
双光源系统流式细胞仪
样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。
进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。
在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。 流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。