外源基因表达与基因工程药物
基因工程药物的研究热点
基因工程药物的研究热点随着社会的发展，人們对内在追求的迫切需要越来越强烈，所以导致现在人们对生物制药技术的发展更加的迫切，同时在各个时期涌现出对其不同程度、不同方向的热点研究。
以下讲述的研究内容为表达系统、细胞因子、转基因植物药用蛋白的热点研究简述。
标签：基因工程药物；研究应用；热点；表达系统；细胞因子；转基因植物；药用蛋白当今社会的四大科学之柱为微电子、生物技术、新型材料以及航天技术。
而随着社会的发展，生物制药的重要性尤其突出，人们对内在追求的迫切需要越来越强烈，所以导致现在人们对生物制药技术的发展更加的迫切，同时在各个时期涌现出对其不同程度、不同方向的热点研究。
简单来说，基因工程药物是指先确定对某种疾病有预防或者治愈的蛋白质，将控制其蛋白质合成的基因取出来，经过一系列基因操作，后经过表达系统表达后，成功的大规模生产这些蛋白质的研究方向和过程。
基因工程药物的发展过程中，首先是转基因的研究以及深入后，后基因组时代就到来了，生物反应器，反义核酸技术等基因技术不断发展和完善，直到今日发展和完善生物药物制剂、大分子药物吸收、转运机理研究和给药系统研究、新药研发等都成为基因工程药物研究的大热点，结合基因组学、蛋白质组学、药物基因学等学科使研究药物更加广泛化和效用化。
一、开发热点之一：表达系统研究可以高效表达外源基因的表达系统是基因工程制药中研究和应用的重要内容之一。
表达系统的高效性决定了外源基因表达的高效性，后对基因工程药物的效用也会产生直接的影响。
我们通常使用大肠杆菌来作为实验的表达载体，也表达成功了许多外源基因。
但是它的缺点也更加明显，比如不能表达复杂的蛋白质、II型分泌表达产物产量低下等原因。
后来，我们又研究哺乳类细胞、昆虫类细胞的表达系统，虽然可以成功的表达结构复杂的蛋白质，但是表达能力低下，产物含量低且操作过于复杂，价格显得过于昂贵，不易普遍推广。
随着研究的进行，研究发现酵母细胞在表达系统上有很强的优势性。
外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
第二章基因工程制药
第一节
概 述
基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展
基因工程：
应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物
遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品
和服 务的技术。
一、基因工程技术生产药品的优点
1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。
超声破碎法
四、固液分离
分离细胞碎片常用的方法有：
1. 离心沉淀：高速离心、超速离心 2. 膜过滤：微滤、超滤和反渗透
3. 双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖
聚乙二醇-无机盐
五、重组蛋白质的分离纯化
分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括： 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。
发夹结构 RNaseH S1核酸
4．cDNA克隆
质粒 入噬菌体 酶、 定向、A T克隆
化 学 法 电 击 转 染
5．将重组体导入宿主细胞 差示 抗体 抗性获得 抗性失活 显色
二、大肠杆菌中的基因表达
2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数 （2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响
二、大肠杆菌中的基因表达
3．表达形式
（1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。
五、重组蛋白质的分离纯化
3. 亲和层析： 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非 常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既 是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这 种结合解除。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
基因工程在生物制药中的应用
基因工程在生物制药中的应用基因工程是一门通过改变和重组生物的遗传物质，以产生有特定功能或特定表现的生物，它在生物制药领域具有重要的应用价值。
本文将重点介绍基因工程在生物制药中的应用。
一、基因工程制备重组蛋白药物重组蛋白药物是通过基因工程技术来制备的蛋白质药物。
通过将目标药物的基因导入到表达系统中，利用细胞的生物合成机制来大量合成目标蛋白质。
基因工程制备的重组蛋白药物具有高纯度、高效性、低副作用等优点，广泛应用于临床治疗。
例如，重组胰岛素、重组生长激素和重组白介素等都是基因工程制备的重组蛋白药物。
二、基因工程研发基因治疗药物基因治疗是指通过外源基因导入宿主细胞中，以纠正或治疗遗传性疾病的一种新型治疗方法。
利用基因工程技术，可以将正常的基因导入到病患的细胞中，恢复其正常的基因功能，从而达到治疗的效果。
基因治疗药物已经在某些遗传性疾病的治疗中取得了一定的成功，并且有望在未来发展中得到更广泛的应用。
三、基因工程改造微生物菌株微生物对于生物制药具有重要的意义，因为它们可以表达并产生大量的蛋白质。
通过基因工程技术，可以将目标基因导入到微生物菌株中，使其能够表达目标蛋白质。
这种改造后的菌株能够高效地合成目标蛋白质，为生物制药的生产提供了可靠的来源。
目前，基因工程改造的大肠杆菌、酿酒酵母等微生物，已经成为生物制药中最常用的表达系统。
四、基因工程构建表达载体在基因工程制备重组蛋白药物时，表达载体是必不可少的工具。
表达载体是一种将目标基因导入到宿主细胞中的介质，它能够稳定地携带和复制目标基因，并确保基因的高效表达。
通过基因工程技术，可以构建具有高效表达的表达载体，为大规模生产蛋白质药物提供了可靠的基础。
五、基因工程筛选和改良药物靶点基因工程技术可以广泛应用于药物靶点的筛选和改良。
通过改变和调控特定基因的表达，可以发现新的药物靶点，并对其进行进一步研究和优化。
基因工程还可以通过合成和改造基因来改变药物分子的结构和功能，提高药物的活性和选择性。
基因工程应用的具体例子
基因工程应用的具体例子基因工程是一门应用广泛且前景广阔的学科，通过对生物体的基因进行修改和调控，可以实现对生物体性状的改良和功能的增强。
下面将列举10个具体的基因工程应用例子。
1. 人类胚胎基因编辑人类胚胎基因编辑是一项具有潜在影响力的基因工程技术，它可以通过修改人类胚胎的遗传信息，来预防或治疗一些遗传性疾病。
例如，科学家们可以利用CRISPR-Cas9技术，修复携带遗传疾病的基因，并防止其遗传给后代。
2. 转基因作物转基因作物是指通过基因工程技术将外源基因导入植物基因组中，使其具备一些新的性状或功能。
例如，转基因作物可以抗虫害、耐旱、耐盐碱等，从而提高作物的产量和抗逆能力。
3. 基因治疗基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法。
通过将正常基因导入患者体内，修复或替代缺陷基因，从而恢复患者正常的生理功能。
例如，基因治疗可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和免疫系统相关的疾病等。
4. 基因工程药物基因工程药物是利用基因工程技术生产的药物，它们可以通过改变患者的基因表达来治疗疾病。
例如，基因工程药物可以用于治疗癌症、糖尿病、血友病等疾病。
5. 基因工程疫苗基因工程疫苗是利用基因工程技术生产的疫苗，它们可以通过引入病原体的基因片段，激活患者的免疫系统，从而预防疾病。
例如，基因工程疫苗可以用于预防流感、乙肝、艾滋病等疾病。
6. 基因工程动物基因工程技术可以用于改造动物的基因组，使其具备人类所需要的一些性状或功能。
例如，科学家可以通过基因工程技术制造转基因小鼠模型，用于研究人类疾病的发生机制和治疗方法。
7. 基因工程显微生物基因工程技术可以用于改造微生物的遗传信息，使其具备一些新的功能。
例如，科学家可以通过基因工程技术制造转基因大肠杆菌，用于生产人类重组蛋白和药物。
8. 基因工程生物燃料基因工程技术可以用于改造植物和微生物的基因组，使其具备高效生产生物燃料的能力。
例如，科学家可以通过基因工程技术改造藻类和细菌，使其能够利用太阳能和二氧化碳合成生物燃料。
生物技术制药试题(打印版)
生物技术制药试题1. 生物技术制药:生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
2. 基因表达:基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。
3. 质粒的分裂不稳定:通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。
在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。
一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。
4. 补料分批培养:发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。
因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。
5. 人-鼠嵌合抗体:嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
6. 悬浮培养:非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
生物药物分析与检验基因工程药物检验
2、有限代次的生产
提供培养生产浓度与产量恒定性的数据； 依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高 允许传种代数和细胞倍增数，并应提供最适 培养条件的详细资料。
3、连续培养生产
应提供经长期培养后所表达基因的分子 完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因 型特征。
4、纯化
对于收获、分离和纯化的方法应详细记 述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗 原性物质的去除。
基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋 白质两类。
蛋白类杂质： 残留宿主细胞蛋白 采用 免疫分析的方法
非蛋白质类杂质：
①病毒污染检查 ②无菌试验 ③热原质试验 ④残余细胞DNA测定。 ⑤抗原性物质检查 ⑥其他外源性物质
常用检测方法：
杂质和污染物
内毒素 宿主细胞蛋白 其它蛋白杂质 残余DNA 蛋白变异
3.表达
应详细叙述在生产过程中，启动和控制克 隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及 表达水平。
(二)生产的控制
在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；
在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定， 始终无突变；
在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；
始终能排除外源微生物污染。
1、原始细胞库
应详细记述种子材料的来源、方式、保存 及预计使用寿命；应提供在保存和复苏条件 下宿主载体表达系统的稳定性证据；采用新 的种子批时，应重新作全面检定。
4.稳定性考察
药品的稳定性是评价药品有效性和安 全性的重要指标之一，也是确定药品贮 藏条件和使用期限的主要依据。
5、 产品一致性的保证
只有对从原料、生产到产品的每一步 骤都进行严格的控制和质量检定，才能 确保各批最终产品都是安全有效、含量 和杂质限度一致并符合标准。
第三节 基因工程药物的检验
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末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease)
➢ 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。
➢ 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等
➢ 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
➢ 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
5’…▼GATC...3’
Nde Ⅰ
5’…GA▼TATG...3’
切割后产生3’突出末端:
Apa Ⅰ
5’…GGGCC▼C...3’
Hae Ⅱ
5’…PuGCGC▼Py...3’
Kpn Ⅰ
5’…GGTAC▼C...3’
Pst Ⅰ
5’…CTGCA▼G...3’
Sph Ⅰ
5’…GCATG▼C...3’
Байду номын сангаас
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA聚合酶Ⅰ ➢ 逆转录酶 ➢ T4 DNA连接酶 ➢ 碱性磷酸酶（修饰酶） ➢ 末端转移酶（修饰酶） ➢ Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
➢ 同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
第十章
外源基因表达与基因工程药物
DNA Recombination Technology
DNA克隆、测序与重组技术的历史
➢ 1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外 重组DNA的分子克隆
➢ 1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的 化学裂解DNA测序问世
➢ 不久，Sanger 等的双脱氧测序法 ➢ 20世纪90年代启动人类基因组计划(human
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
➢同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的 药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。
重组DNA技术
• 重组DNA技术：
又称基因工程，是DNA克隆所采用的技术和相关工作的统称。DNA克隆是 重组DNA技术的核心，即将某种DNA片段与DNA载体连接成重组DNA，导入 细胞进行复制，并随细胞分裂而扩增，最终获得该DNA片段的大量拷贝。
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具 有 自 我 复 制 能 力 的 DNA 分 子 —— 复 制 子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
➢ 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
➢ 作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
➢ 命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
➢ 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。
➢ 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
➢ 技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
➢DNA克隆过程：
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
限制性内切核酸酶
名称
识别序列及切割位点 名 称
识别序列及切割点
切割后产生５’突出末端:
BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’
Bgl Ⅱ
5’…A▼GATCT...3’
EcoR Ⅰ
5’…G▼AATTC...3’
Hind Ⅲ
5’…A▼AGCTT...3’
Hpa Ⅱ
5’…C▼CGG...3’
Mbo Ⅰ
genome project，HGP) ➢ 重组DNA技术学(Recombinant DNA
Technology)
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传