第四章 动物细胞制药

1、 贴壁培养 分散的贴壁依赖性细胞悬浮在培养瓶中很快(几十 分钟至几小时)就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁， 贴壁后的细胞形态形成多态性， 呈单层生长， 所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保 持接触抑制的特性。 优点：适用的细胞种类多；可采用灌流方式进行 高密度培养。 缺点：需较大面积和贴附材料；培养条件难以均 衡。传代培养时需用胰酶等将细胞从基质上消化 下来。
脂质体介导法：
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法 细胞融合法 化 学 法 DNA—磷酸钙 沉淀法 脂质体介导法 DEAE—葡 聚糖法 原生质融合法 染色体介导法 微细胞介导法 鬼影红细胞介导法 物 理 法 电穿孔法 显微注射法 基因枪法 病 毒 法 重组逆转录病毒 介导法 重组DNA 病毒介导法 多瘤病毒样 颗粒介导法
2、二倍体细胞系：细胞群中染色体数 目与原供体二倍体细胞相同或基本相 同，可进行有限培养，具有贴壁依赖 性和接触抑制现象，无致瘤性。
３、转化细胞系：即无限细胞系 自发或诱导形成：正常细胞的培养传 代过程中发生染色体断裂或异倍化； 或人为地应用某些病毒和化学试剂诱 导获得。 由肿瘤细胞建立的细胞系全部为转化 细胞。 培养条件和要求简单，繁殖快，利于 大规模生产。
灭菌： 物理消毒：紫外线、干热、高压高温、过 滤等 化学消毒：消毒剂、抗菌素等 目的: 防止微生物污染。
2、水的处理： 方法：蒸馏、离子交换、电渗析、中空纤维过 滤等 目的：去除有毒元素、金属离子、微生物 3、pH的调整： 理想的pH应为7.2~7.4，整个培养过程不高于 7.6，低于6.8可限制细胞增殖。 控制pH的方法：使用pH电极； 使用各种缓冲 液系统。
1962年 动物细胞大规模培养技术起步 1975年 Sato无血清培养细胞获得成功 1975年 Kohler和Milstein成功构建了 杂交瘤细胞 1989年 Konstantinovti首次提出大规 模细胞培养过程中生理状态控制
细胞工程：以细胞为单位，按人们的意志， 应用细胞生物学、分子生物学等理论和技 术，有目的地设计和操作，使细胞的某些 遗传特性发生改变，从而达到改良或产生 新品种的目的，以及使细胞增加或重新获 得产生某种特定产物的能力，以便在离体 条件下进行大量培养、增殖，并提取出对 人类有用的产品。
2、无血清培养基: 基础培养基+补充因子 必须补充因子：胰岛素(激素)、转铁蛋白 (结合蛋白)等。 特殊补充因子：生长因子、贴壁因子等。
第五节
动物细胞培养的 方法和操作方式
一、大规模培养的方法
培养的分类： 按培养细胞种类分：原代培养、传代培养 按培养基分：固体培养、液体培养 按培养方式分：静止、旋转、搅拌、微载 体、中空纤维、固定床和流化床培养等 按生产实际分：悬浮、贴壁和贴壁—悬浮 培养
MDCK cells on a microcarrier, sample from a stirred 5 L bioreactor
22 h after infection 5 h after infection
10 h after infection
Tumor cells aggregate on microcarrier beads (indicated by arrow).
多孔微载体：其内部具有网状结构的小孔， 细胞能在其内部生长，是适用于大规模高 密度细胞培养的细胞支持物。 特点： 增加了供细胞贴附的比表面积； 增加细胞固定化稳定性； 细胞生长在载体内部，不易受机械损伤； 可提高搅拌强度和通气量。
二、培养基的种类和组成
1、天然培养基: 鸡血浆、水解乳蛋白、淋巴液、血清等 成分复杂，不稳定，不适于大量培养。 2、合成培养基: 基础培养基： 组成：氨基酸、维生素、糖类、无机盐、 核酸前体、氧化还原剂等
基础培养基+血清: 最常用的是5%~10%的小牛血清，或 10%~20%胎牛血清。 血清中包含生长因子、激素、贴壁因子、 伸展因子、结合蛋白、脂肪酸及微量元素 等。血清可还可作为pH缓冲系统。
高效表达工程细胞株的筛选：
利用转入筛选标志基因，其表达产物能 赋予细胞一个特性，如使细胞产生对特 定药物的抗性作用或荧光作用等，从而 将转染与无转染细胞分开。 筛选出的转染细胞要进行克隆和亚克隆 使其纯化，扩增，从而获得高效稳定的 工程细胞株。
第四节
动物细胞的培养条件 和培养基
动物细胞培养的基本条件
悬浮细胞： 不依赖支持物的表面生长，可在 培养液中悬浮生长的一类细胞，如 淋巴细胞、一些肿瘤细胞等。 兼性贴壁细胞： 不严格依赖支持物，既可贴壁生 长，也可悬浮生长。如CHO 细胞等。
初代(原代)培养： 直接从体内取出的细胞、组织和 器官进行的第一次培养。 细胞系： 初代培养物开始第一次传代后的 细胞，可分为有限细胞系和无限细胞 系。
接触抑制现象： 贴壁依赖型细胞在生长分裂中，当 与其他细胞相互接触时即停止分裂， 细胞浓度不再增加的现象。又称为 接触抑制或密度依赖抑制。
第二节、动物细胞的形态 和生理特点
动 物 细 胞 示 意 图
各 种 形 态 的 动 物 细 胞
各 种 形 态 的 动 物 细 胞
二、动物细胞的生理特点
绝对无菌的外界环境 充足良好的营养供应 适量干净的氧气供给 及时清除有害的产物 适当充分的生存条件 精细准确的技术操作
一、培养条件
1、器材的处理 清洗: 浸泡 → 刷洗 → 泡酸 → 冲洗 → 干燥 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
磷酸三钠 专用洗涤剂 酸液 低水,高水 干燥箱
目的: 尽可能地消除残余蛋白质，细胞及化学物质。
4、渗透压的调整： 由于动物细胞没有细胞壁，外界环境渗 透压的大小对细胞的存活有很大影响。 控制的方法：在培养基中添加生理平衡 盐溶液BSS（无机盐和葡萄糖组成）。 5、温度的控制： 最佳培养温度：哺乳动物细胞37±0.5℃ 昆虫细胞27℃
6、氧气： 动物细胞培养离不开氧气，高密度培养 时尤为重要。 在大规模培养时应不断加入调整后的氧 气。 方法：转瓶培养时，留够空间； 采用 生物反应器时，表面通气、鼓 泡、培养基灌流等。
第四章 动物细胞制药
第一节
概述
组织培养（细胞培养）：将组织或 细胞从机体取出，在体外模拟机体 体内的生理条件下进行培养，使之 生存和生长。
细胞培养大事记
1885年 1907年 1951年 1957年 Roux用生理盐水培养鸡胚组织 Harrison创立体外组织培养技术 Earle等开发人工合成培养基 Graff创造悬浮细胞培养
质粒载体：主要是穿梭质粒载体。 具能在哺乳动物细胞中表达的强启动子； 具增强子； 具原核、真核细胞的筛选标志基因； 具原核复制起始区等。 同一表达载体、同一启动子在不同类型细 胞中效果差异较大，应作大量预备实验。
Hale Waihona Puke ２、基因载体的导入和高效表达工程细 胞株的筛选
磷酸钙法: 用磷酸钙微量沉淀外源DNA，然 后与培养细胞混合，靶细胞会摄入沉淀物， 外源DNA被结合进核，发生DNA整合，渗入 受体的基因组中，完成转染。 简单易操作。 电击(穿孔)法：电击仪产生的高压脉冲电场使 细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA即沿 小孔进入细胞。 进入细胞的DNA拷贝数低。
1、细胞分裂周期长：分裂时间随细 胞种类的不同而不同，培养条件的变 化而变化。一般为12-48 h。 2、正常二倍体细胞一般为贴壁依赖 型细胞，有接触抑制现象。但异倍体 细胞则没有这种现象。
3、正常二倍体细胞的生长寿命有限 很多二倍体细胞培养系是有限细胞系，细 胞经若干代传代培养后将逐渐死亡。存活 时间决定于细胞来源的种族和年龄。 普通人的成纤维细胞可传代数=50； 鸡胚细胞可传代数=30； 小鼠细胞可传代数=8； 年龄↗培养代数↘。 异倍体细胞是无限细胞系，可无限期培养。
4、由于没有细胞壁，动物细胞比较娇弱， 对周围环境敏感，对变化的耐受力差。 5、对培养基要求高： 相对于植物、微生物来说，动物细胞对培养 基的要求较高，不仅需要12 种必需氨基酸， 各种维生素、无机盐、葡萄糖和微量元素， 还需要多种细胞生长因子、贴壁因子及其他 元素，要求苛刻。
6、蛋白质的合成途径与修饰功能与细菌不 同 动物细胞: 游离核糖体→细胞质基质→蛋白质合成→胞质 中 与糙面内质网结合的核糖体→蛋白质合成→糖 蛋白(糖基化) →消化和分泌 原核细胞: 无糙面内质网，不能使蛋白质糖基化。
动物细胞工程生产的药品应用于临 床诊断、治疗和预防，包括癌症、 心血管病、血液病、内分泌病、贫 血及外伤等。 动物细胞制药是许多发达国家大力 投资的重要产业。
动物细胞培养和制药 中的一些有关名词
贴壁（依赖型）细胞: 必须贴附于固体介质表面上生长 的细胞，这些细胞在贴壁生长铺 满生长表面形成单细胞层后，由 于接触抑制现象而停止生长。大 多数正常二倍体细胞属此型。
三、基因工程细胞的构建和筛选
１、真核细胞基因表达载体的构建：
病毒载体：一般是去掉一些病毒复制和包 装需要的结构蛋白基因，重组进外源基因， 保留包装识别序列和复制序列。由于改造 后病毒为自身复制缺陷型，从而防止了病 毒自身在宿主细胞内增殖。 优点：外源基因导入率高； 缺点：操作麻烦。
MDCK cells in suspension
3、贴壁—悬浮培养：适用于大规模培养
（1）微载体培养：微载体是直径为60-250μm的 微珠。将细胞接种于微载体表面后悬浮于培养液 中培养。 优良微载体的特性：不含毒性成分；与细胞相容 性好；密度适中，略大于培养基；粒径适度，表 面光滑；有良好的光学透明性；耐高温灭菌；非 刚性材料；不吸收培养基成分；易收获细胞及其 制品；廉价，能重复使用。目前应用较广微载体 系统: 交联葡聚糖－Cytodex 优点：既有较大的贴附面积，又能悬浮于培养液 中，适于生产性培养。 缺点：培养后期细胞老化后容易从微载体上脱落。