20、第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用
预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
一、分子用研究技术
目录
第一节 分子杂交与印迹技术
Cycle 3
5
5
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5
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5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
目录
PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
目录
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
常用分子生物学技术的原理及其应用
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
01
03
基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
01
02
03
04
基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用概述分子生物学技术是现代生物学研究中应用广泛的一系列技术方法。
这些技术能够帮助科学家从分子水平上理解生物学系统的结构和功能，并促进相关研究的进展。
本文将介绍几种常用的分子生物学技术，并详细探讨它们的原理和应用。
1. 聚合酶链式反应（PCR）•原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外合成DNA的方法，通过循环性反应使DNA的数量迅速扩增。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热使其解旋成两条单链。
在退火步骤中，引物与模板DNA序列互补碱基配对。
在延伸步骤中，热稳定DNA聚合酶将新的DNA链延伸。
•应用：PCR技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因突变分析、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
此外，PCR还常用于检测病原体、肿瘤标记物以及遗传性疾病的诊断。
2. 凝胶电泳•原理：凝胶电泳是一种分离DNA和蛋白质的常见方法。
该技术基于物质在电场中的迁移速度不同，利用电势差将分子分离开来。
DNA片段在凝胶中迁移速度与其大小有关，大片段迁移较慢，小片段迁移较快。
•应用：凝胶电泳广泛应用于DNA分析、蛋白质分析以及核酸杂交等实验中。
在分子生物学研究中，凝胶电泳可用于确认PCR扩增产物的大小，并进行DNA片段的分离和纯化。
此外，它还可以检测基因突变、遗传关系等。
3. 蛋白质电泳•原理：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
该技术基于蛋白质的大小、电荷和形状差异，利用电势差将蛋白质分离开来。
在电泳过程中，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电场迁移。
•应用：蛋白质电泳在生物学研究和临床诊断中具有重要作用。
它可以用于鉴定蛋白质在细胞中的表达水平、研究蛋白质结构和功能以及检测特定蛋白质的存在与否。
此外，蛋白质电泳还用于分离和纯化重组蛋白质。
4. 核酸杂交•原理：核酸杂交是一种通过互补碱基配对而发生的分子相互作用。
通过标记的探针DNA或RNA与靶序列相互结合形成稳定的双链或三链结构，从而可进行检测和定位。
常用分子生物学技术的原理及其应用
酵母双杂交系统的应用 分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析 分析未知蛋白相互作用 绘制蛋白质相互作用系统图 在药物设计中的应用
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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实时PCR技术原理 实时PCR技术原理 PCR
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(略 )
第六节 遗传修饰动物模型的建立及应用 The establishment and application of heredityhereditymodified animal model
一. 转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎 干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。
医本<生物化学> 医本<生物化学>周爱儒 第六版
第二十二章 常用分子生物学技术的原理 及其应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting 库
是指一个包含了 某一生物体全部DNA 某一生物体全部 序列的克相关基因的克隆与鉴定 Cloning and identification of disease relative gene
分子杂交(nucleic acid hybridization) 一. 分子杂交
不同来源的单链核酸经退火形成双链结构的过程。 不同来源的单链核酸经退火形成双链结构的过程。
DNA DNA DNA RNA
基础：核酸的变性与退火 基础：
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用一、PCR技术1.PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，主要用于扩增DNA片段。
2.PCR技术的原理是通过添加DNA模板、引物和DNA聚合酶，以及一系列特定的温度循环，迅速扩增目标DNA序列。
3.PCR技术的应用广泛，如基因克隆、基因突变分析、疾病诊断等。
二、蛋白质电泳技术1.蛋白质电泳技术是用于分离和定量蛋白质的常用方法。
2.蛋白质电泳技术包括SDS-PAGE和蛋白质西方印迹等。
3.SDS-PAGE是一种蛋白质分子量分析方法，通过凝胶电泳分离蛋白质。
4.蛋白质西方印迹则用于检测特定蛋白质的表达，并通过特异性抗体与该蛋白质结合，产生特定的信号。
三、原位杂交技术1.原位杂交技术是研究基因表达和基因组结构的重要工具。
2.原位杂交技术通过结合特异性探针和标记物，用于检测目标序列在组织或细胞中的分布。
3.原位杂交技术有多种类型，如荧光原位杂交（FISH）和非放射性原位杂交等。
4.原位杂交技术在遗传学研究、疾病诊断和生物学研究中得到广泛应用。
四、基因克隆技术1.基因克隆技术是将特定DNA片段插入到载体DNA中的技术。
2.基因克隆技术的关键步骤包括：DNA片段的切割、载体DNA的选择和连接、转化等。
3.基因克隆技术在基因工程、重组蛋白质的表达以及基因功能研究等方面具有重要应用。
五、DNA测序技术1.DNA测序技术是用于确定DNA序列的方法。
2.DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序等。
3.Sanger测序是一种经典的测序方法，逐个位置确定DNA序列。
4.高通量测序技术通过并行测序大量的DNA片段，实现快速高效的DNA测序，并被广泛应用于基因组学研究、药物研发等领域。
六、蛋白质质谱技术1.蛋白质质谱技术是分析蛋白质结构和功能的重要方法。
2.蛋白质质谱技术包括质谱仪的使用和蛋白质样品的制备等。
3.蛋白质质谱技术能够快速鉴定蛋白质样品中的蛋白质组分，并定量分析特定蛋白质的表达水平。
分子生物学技术及其应用
分子生物学技术及其应用随着科技的不断发展，分子生物学技术已经逐渐成为了生物学前沿研究中的重要工具之一。
从最早的基因克隆技术，到现在的基因编辑和重编程技术，分子生物学技术已经广泛应用于药物研发、生物治疗、基因诊断等多个领域。
本文将着重介绍分子生物学技术的基本原理、主要应用及对未来科技发展的影响。
一、分子生物学技术的基本原理分子生物学技术是一种借助于分子生物学理论，利用各种化学和物理手段对生物大分子进行操作和研究的技术。
其基本原理在于利用生物大分子的物理性质和化学性质来进行分离、纯化和分析。
其中，分子生物学技术的核心是DNA分子的操作和研究。
DNA分子作为生物体内的遗传物质，其结构和功能的研究对于理解生物现象和生命本质有着重要作用。
因此，在分子生物学技术中，对于DNA的操作和研究显得尤为重要。
二、分子生物学技术的主要应用1. 基因克隆技术基因克隆技术是指将DNA分子从源生物体中剪切并插入到另一个宿主生物体中的技术。
其应用广泛，例如在基因疗法、基因工程、药物研发和农业生产等领域中都有重要的作用。
2. 基因编辑技术基因编辑技术是利用CRISPR-Cas9系统定点修改基因序列的技术。
其应用广泛，可用于基因治疗、基因诊断及疾病预防等领域。
3. DNA测序技术DNA测序技术是指通过对DNA分子的测序来分析DNA序列信息的技术。
其应用广泛，可用于遗传病诊断、药物研发、生态环境研究等领域。
4. 基因表达分析技术基因表达分析技术是指通过各种分析手段对基因表达水平进行分析的技术。
其应用广泛，可用于疾病诊断、药物研发、基因工程等领域。
5. 基因组编辑技术基因组编辑技术是指将基因组中的特定部位进行编辑的技术。
其应用广泛，可用于基因治疗、药物研发等领域。
三、分子生物学技术对未来科技发展的影响随着分子生物学技术的不断发展，其在生物医学、农业、环境保护、食品安全等领域中的应用越来越广泛。
分子生物学技术的出现和发展带来了许多新的机遇和挑战。
第20章常用分子生物学技术的原理及其应用
第20章常用分子生物学技术的原理及其应用分子生物学技术是研究生物分子结构、功能、调控及其相互关系的重要手段，具有识别、分离、纯化、检测和重组生物分子的功能。
在生命科学研究和生物技术应用中，常用的分子生物学技术主要包括核酸提取、聚合酶链式反应（PCR）、限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）、DNA测序、原位杂交、Northern和Southern blot杂交等。
下面将介绍这些常用分子生物学技术的原理及其应用。
1.核酸提取：核酸提取是从细胞或组织中获得目的核酸的方法。
其原理是通过细胞破碎及蛋白酶消化等步骤，将细胞内的核酸释放出来，并进行纯化。
核酸提取技术广泛应用于基因克隆、基因组学研究、医学诊断以及法医学中的DNA分析等领域。
2.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种体外合成DNA的技术，通过多轮的循环温度反应，可以快速扩增一段特定的DNA序列。
其原理是利用DNA聚合酶酶活与特定引物的作用，在一系列温度循环中，使DNA序列通过链分离、引物结合、DNA合成循环进行扩增。
PCR技术被广泛应用于基因分型、基因克隆、突变检测、DNA测序等领域。
3.限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）：RFLP是一种检测DNA序列多态性的方法，通过限制酶切割目的DNA，在凝胶电泳中观察DNA片段的长度差异。
其原理是利用限制酶对特定序列的识别和切割，形成不同长度的DNA片段，经凝胶电泳分离，通过核酸探针杂交或染料染色等方法来观察差异。
RFLP技术广泛应用于基因分型、基因组学研究、变异检测等领域。
4. DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的方法，通过测定DNA的碱基顺序，揭示基因组结构和功能。
常用的DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序。
Sanger测序原理是利用DNA聚合酶、引物和一种特殊的停止链终止剂，在DNA合成过程中随机终止，形成不同长度的DNA片段，通过电泳分离后，通过染料或探针检测碱基顺序。
高通量测序技术基于快速测序平台和大规模并行测序，提高了测序效率和准确性，广泛应用于基因组学、转录组学等领域。
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目录
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交
(nucleic acid hybridization)
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
（一）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以 cDNA 或基因组 DNA 为模板获
得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直
接以组织和细胞的mRNA为模板获得目 • 利用随机引物从 cDNA 或基因组中克隆 基因。目录
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹 (Southern Blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹 (Northern Blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
目录
克隆疾病相关基因的策略
• 功能克隆(functional cloning) • 定位克隆(positional cloning)
目录
（一）功能克隆
定义
从对一种致病基因的功能的了解出发来 克隆该致病基因。
光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
目录
DNA序列自动分析原理及结果图
绿色 荧光
蓝色 荧光 红色 荧光
ddG ddA ddT ddC
黄色 荧光
电目录基因(genelibrary)
是指一个包含了某一生物体全部DDNA的 信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA
片段形。目录基因组和cDNA的构建和筛选目录
基因组筛选结果举例目录酵母双杂交系统的应用
• 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用
的生物信息学推测。
• 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的
相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。
• 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成 为“诱饵”表达质粒， 5
5 5
5 5
5
5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR体系基本组成成分
• 模板DNA
• 特异性引物
• 耐热DNA聚合酶
• dNTPs
• Mg2+
目录
PCR的基本反应步骤 变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
二、PCR技术的主要用途
目录
复性
RNA
DNA
目录
（一）印迹技术
利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因 此称之为“blotting”，译为印迹技术。
目录
（二）探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
assay)。
目录
（二）定位克隆
定义
从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩 小范围，最后克隆该基因。
目录
核酸序列分析的基本原理：
• 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) • DNA链的末端合成终止法 (Sanger法)
目录
一、DNA链末端合成终止法
目录
链末端合成终止法测定DNA序列的原理
G
ddG
A
ddA
T
ddT
C
ddC
测序反应 电泳
正极
AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A
immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可
以研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的 主要方法。
目录
染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图
目录
第七节
遗传修饰动物模型的建立及应用
The Establishment and Application of
Heredity-Modified Animal Model
的的激活的卵细胞内，使之发育成个体， 即克隆(clone)。
目录
三、基因剔除技术
基因剔除技术(gene
knock out)
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
目录
操作方式
将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重 组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭
负极
3'
5'
目录
二、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现 DNA 序
列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种
双脱氧核苷酸，然后进行 Sanger 测序反应，反应
产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后， 通过四种激光激发不同大小 DNA片段上的荧光分
子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧
目录
（三）实时PCR技术
实时PCR(real-time PCR)技术通过动态 监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积 对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。
目录
实时PCR技术原理
荧光标记引物
3'
R
Q
5'
上游 引物
5'
下游 3' 引物
R
3' 5'
Q
5' 3'
目录
第三节 核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
术也被用于研究 RNA结合蛋白和特定 RNA序列间
的相互作用。
目录
凝胶迁移实验结果示意图
未标记探针 核蛋白提取物 标记探针
10X
1X
1X
10X 1X
10X 1X
1X
结合有蛋白的探针
放 射 自 显 影
未结合探针
目录
（二）染色质免疫沉淀法
染 色质免 疫沉淀 技术 ( c h ro m a t i n
The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study
目录
一、蛋白质相互作用研究技术
常用蛋白质相互作用的研究技术
• 酵母双杂交 • 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）
• 荧光共振能量转换效应分析
• 噬菌体显示系统筛选
第20章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting Technique
活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊
胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最
终形成嵌合体小鼠。
目录
四、基因转移和基因剔除在医学 发展中的作用
建立动物模型
① 单基因决定疾病模型 •基因剔除 •获得性突变(gain-of-function mutation)
② 多基因决定疾病模型
目录
第八节
疾病相关基因的克隆与鉴定
目录
二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术
（一）电泳迁移率变动测定
电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility
shift assay ， EMSA) 或称凝胶迁移变动实验 ( gel shift assay) 最初用于研究 DNA 结合蛋白与相应 DNA 序列间的相互作用，可用于定性和定量分析， 已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技
目录
其他：
斑点印迹 (dot blotting)
原位杂交 (in situ hybridization)
DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
目录
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
②
①
③
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
目录
DNA点阵
目录
第二节
聚合酶链反应
基因芯片(gene
chip)
是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排
列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧
光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等 对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的 荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出 定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列
(DNA microarray)。
目录
（一）标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱
原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结
合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结
合的未知分子。
目录
标签融合 蛋白沉淀 实验流程 示意图
目录
（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途
应用
生化机制已明确、基因表达产物较易得 到部分纯化的遗传性疾病。
目录
利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
用不同人的DNA片段转化与人类遗传疾病具有