分子生物学常用技术(简化版)
常用的分子生物学基本技术简介
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR 法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。
测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。
目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。
化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。
一般能读出200-250个核苷酸序列。
双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。
基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。
至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。
目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。
分子生物学内容方法
分子生物学内容方法
分子生物学是一个广泛的领域，涉及到生物大分子的结构、功能和相互作用。
在这个领域中，有许多不同的方法和技术，用于研究和分析分子生物学方面的问题。
以下是一些常见的分子生物学方法：
1. 基因克隆：这个方法可以用于将目标DNA片段插入到表达载体中，从而生产大量目标蛋白质。
这个过程涉及到PCR、DNA纯化、限制性酶切和连接等步骤。
2. 蛋白质纯化：这个方法通常用于从细胞中提取和纯化目标蛋白质。
这个过程涉及到细胞破碎、离心、柱层析和电泳等步骤。
3. DNA测序：这个方法用于确定DNA分子的序列。
这个过程涉及到DNA扩增、纯化、测序和分析等步骤。
4. PCR：这个方法用于扩增目标DNA片段。
这个过程涉及到DNA模板、引物、酶和缓冲液等组分。
5. RNA干扰：这个方法用于沉默特定基因的表达。
这个过程涉及到合成siRNA和转染细胞等步骤。
6. 蛋白质互作：这个方法用于研究蛋白质之间的相互作用。
这个过程涉及到酵母双杂交、GST pull-down和共免疫沉淀等步骤。
总的来说，分子生物学方法是一个不断发展和改进的领域，可以用于解决许多生物学问题。
不同的方法和技术可以根据具体问题的需要进行选择和组合。
- 1 -。
分子生物学的方法和技术
分子生物学的方法和技术随着科技的不断进步，人们对于分子生物学的研究也越来越深入。
分子生物学是研究生物分子结构、功能及其相互作用的一门学科。
它在疾病诊断、基因工程、药物研究开发等领域都有着广泛的应用。
在分子生物学研究中，有很多的方法和技术可以用来解决问题，下面我们就一起来了解一下。
1. PCR技术PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种能够在试管中扩增DNA的技术。
它是创造性的方法，也是分子生物学领域中最重要的技术之一。
PCR技术在DNA的克隆、基因突变分析、DNA测序和基因表达分析等方面都有着广泛的应用。
PCR技术不仅能够扩增某一个基因的DNA序列，还可以同时扩增多个基因。
2. DNA芯片技术DNA芯片（DNA microarray）技术是一种高通量的基因表达分析技术。
它采用了DNA探针上的互补逆序列来检测样品中的RNA的含量。
DNA芯片技术可以同时检测大量基因的表达水平，从而了解集体基因表达模式的变化。
这种技术在肿瘤、遗传病、心脑血管疾病等方面的研究中都有着广泛的应用。
3. 蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术是一种用来分析蛋白质结构和功能的技术。
这种技术通过分析样品中的蛋白质，可以了解蛋白质的分子量、结构、功能等信息。
它是基于分子重量差异和氨基酸序列的分析方法。
蛋白质质谱技术在药物研发、代谢组学、蛋白质组学等方面的应用日益广泛。
4. 基因敲除技术基因敲除技术是一种用来破坏特定基因并研究这些基因功能的技术。
该技术通过利用针对该基因的RNA，以及CRISPR/Cas9蛋白质等工具，来破坏特定的基因。
基因敲除技术在遗传学、肿瘤学、药物研发等领域都有着广泛的应用。
5. 单细胞测序技术单细胞测序技术是一种可以针对单个细胞的基因组或转录组DNA测序技术。
这种技术可以检测一个基因在一个单独的细胞中的表达，从而了解细胞的类型和功能。
它在免疫学、发育学、神经科学等领域的研究中都有着广泛的应用。
分子生物学实验技术分类
分子生物学实验技术分类分子生物学实验技术是现代生物学研究中不可或缺的一部分，它涉及到对生物体内分子结构、功能和相互作用的研究。
这些实验技术在基础科学研究、医学诊断和药物研发等领域发挥着重要作用。
在分子生物学实验技术中，根据其应用和原理可以进行分类，主要包括以下几类：1. 基因克隆技术，基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它包括DNA片段的定向克隆、质粒构建、DNA序列分析等。
通过基因克隆技术，研究人员可以将感兴趣的基因或DNA片段放入适当的载体中，进行进一步的研究和应用。
2. 蛋白质分离和纯化技术，蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能的研究对于理解生物学过程至关重要。
蛋白质分离和纯化技术包括凝胶电泳、亲和层析、离子交换层析等方法，可以将混合的蛋白质样品分离并得到纯净的蛋白质。
3. 核酸分离和检测技术，核酸是生物体内的遗传物质，包括DNA和RNA。
核酸分离和检测技术包括DNA/RNA提取、聚合酶链式反应（PCR）、原位杂交等方法，可以用于检测和分析生物体内的核酸序列。
4. 基因组学和转录组学技术，基因组学和转录组学技术是对生物体内所有基因组和转录组的研究，包括全基因组测序、RNA测序、ChIP-seq等方法，可以帮助研究人员全面了解生物体内基因的组成和表达模式。
5. 蛋白质-核酸相互作用技术，蛋白质和核酸之间的相互作用对于细胞内的生物学过程至关重要。
蛋白质-核酸相互作用技术包括免疫共沉淀、荧光共聚焦、电泳迁移变性等方法，可以帮助研究人员研究蛋白质和核酸之间的相互作用。
以上是分子生物学实验技术的一些分类，这些技术的不断发展和创新为生物学研究提供了强大的工具，也推动了生物医学领域的进步。
在未来，随着技术的不断进步，分子生物学实验技术将继续发挥重要作用，为人类健康和生命科学研究带来更多的突破和进展。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
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根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
10
(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
分子生物学常用技术
用途：
RNA（甲醛、乙二醛等）
检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；
比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
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North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记)
⑤底物与抗体-HRP /AP反应, 显色或发光
③杂交：Dig 标记的探针与 靶DNA结合
底物
D│ D│
① 电泳,转膜， 紫外交联固定
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2
第一节
分子印迹与杂交技术
Molecular Blotting & Hybridization Technology
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一、核酸分子印迹与杂交技术 学习要求 1
印迹(blotting)
指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大 分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成 为固相化分子的过程。
①电泳分离,转膜, 固定蛋白于膜上
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②漂洗和封闭
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优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带
缺点： 1.免疫反应性较低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
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2. Western Blotting间接法操作流程:
⑤底物与二抗-HRP/ AP反应, 显色或发光
• 用Western blotting检测样品中存在特异蛋白质 • 用于细胞中特异蛋白质的定量分析 • 用于蛋白质分子的相互作用研究
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1. Western Blotting直接法操作流程:
④底物与抗体-HRP / AP反应, 显色或发光
分子生物学常用技术(简化版)
2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列
标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
精品课件
放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列
反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
精品课件
dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高
精品课件
2. 非放探针的酶促标记
生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可 以参入探针
精品课件
3. 非放探针的化学标记
利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合
精品课件
四、如何进行杂交？
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等
与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行
标记方法
标记物
探针
缺口平移
同位素或半抗原DNA探针
随机引物标记 同位素或半抗原DNA探针
5’ 或3’ 末端标记 同位素
寡核苷酸探针
PCR标记 体外转录
同位素或半抗原DNA探针 同位素或半抗原单链RNA探针
化学标记
半抗原
均可
精品课件
1. 缺口平移
nick translation: 适用于标记双链 DNA 控制 DNase I 的 用量，可以控制 探针的长度
第四篇：分子生物学技术与应用
分子生物学常用检测技术
二、核酸分子杂交
根据核酸变性和复性 的原理，不同来源的 变性单链核酸分子在 合适的条件下，通过 碱基互补形成双链杂 交体的过程称为核酸
分子杂交
（molecular hybridization）。
核酸分子杂交的临床应用
• • • • •
1、遗传病的诊断 2、病原体的鉴定 3、癌基因突变的检测 4、组织配型 5、亲子鉴定
或
2+
和
dCTP dGTP dTTP dATP 模板 引物
PCR的种类
• 荧光定量PCR
• 通PCR • 原位PCR
• 免疫PCR
• ……
荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
R
5' 3'
probe
Q
3' 5' 3' 5'
5'
三、基因芯片技术
• 基质材料分， 有尼龙膜、玻 璃片、塑料、 硅胶晶片、微 型磁珠等。
用点样法固定 在玻璃板上的DNA 探针阵列
原位合成法在玻璃等 硬质表面上直接合成 的寡核苷酸探针阵列
基因芯片技术的应用
1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业
四、测序技术
（一）一代测序技术
平台期
指数增长期 循环数Cycle Number
CT = - k logN0 + b
PCR的临床应用
对病原微生物核酸进行快速检测
弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究
用于遗传病的诊断
样本采集要求
项目
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3’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5’
RNA引物 RNA引物
3’
5’ 引物酶 3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
5’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成 新链 延伸
3. 如何检测杂交信号？
同位素标记物： 盖革计数器、液体闪烁计数器 放射自显影(autoradiography)
如何检测杂交信号？
非放射性标记物： 酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay) 化学发光(chemiluminescence)
三、如何对核酸探针进行标记？
一、基本原理
变性(denature) 复性(renature) 杂交(hybiridization)
核酸变性
在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程 破坏氢键与疏水作用可导致变性
热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时 任何核酸双链都将变性 酸碱变性：pH<3 或 pH>11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可 化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素 或甲酰胺可使核酸变性
一、PCR 的基本原理
在体外，以特定引物引 导，通过 DNA 聚合酶 选择性扩增特定区域 变性(denature)
退火(anneal) 延伸(extension)
DNA的体内复制
DNA解 旋解链
5’
3’
Байду номын сангаас
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 解旋酶解链酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
Taq
Taq
Taq
第2轮结束
第1轮扩增 模板DNA 第2轮扩增
第3轮扩增
重复30轮后 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 230=1,073,741,824
n 循环次数
理想拷贝数=2n
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
DNA的体外扩增
1 2 3
高温变性 低温退火 适温延伸
5’ 3’
变性 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
加 热 退 火
复性
94℃
模板DNA
55℃
引物1
DNA引物
引物2
72℃
Taq酶
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
94℃
第2 1轮开始 轮结束
Taq
55℃ 72℃
引物的解链温度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)
引物设计原则
引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现 发卡结构
两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列
二、做 PCR 要有什么条件？
酶：Taq DNA 聚合酶
模板 DNA：可以为基因组 DNA 或 cDNA 引物：人工合成的寡核苷酸片段 dNTP：聚合反应的核苷酸单体 缓冲液：包含特定的 pH、离子强度和 Mg2+
反应程序：变性、退火、延伸组成的循环
仪器：DNA 热循环仪，或称 PCR 仪
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
反 Northern 杂交：将探针 DNA 片段固定在杂交膜 上，利用标记物标记的 RNA 进行杂交
第二节：聚合酶链式反应
PCR，polymerase chain reaction
在体外选择性扩增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的 合成手段和适合的酶而无法进行 1984 年 Kary Mullis 发明 PCR，并因此获得 1993 年的诺贝尔化学奖 全自动的热循环仪和多种 PCR 衍生技术使其成为 重要的科学研究手段
1. 探针有哪些种类？
DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探 针，一般为双链，也可制备成单链 RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链 寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测 人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列
变性温度
Tm：melting temperature，解链温度或变性温度 影响变性温度的因素： 溶液的离子强度 变性温度与离子强度
正相关，低盐利于变性
DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24
核酸复性
变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双 螺旋结构的过程 复性类似与化学反应，需要一定反应时间
2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列 标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列 g→mg→μg→ng→pg→fg 常用的放射性同位素
dNTP
DNA聚合酶催化的聚合反应
1. 什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多 目前常用 Taq DNA 聚合酶 纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
热 循 环
温 度 72 （℃）
94
重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
DNA 解 链
DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋 新链延伸
55 22
1
2
3
时间（min）
4
5
DNA的体外扩增
PCR反应体系
4种dNTP混合物 各200 µ mol/L 引物 各0.1-0.5 µ mol/L 模板DNA 0 .1 ～ 2 µ g Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5mmol/L
有保真性的耐热 DNA 聚合酶吗？
Pfu DNA polymerase：
常用的高保真耐热 DNA聚合酶 有5’ →3’ 外切活性 错误率约 1×10－6 适应于基因克隆
2. 如何设计寡聚核苷酸引物？
引物(primer)是 PCR 反应必备的前提，对 PCR 产物 类型、长度和反应的特异性具有决定作用
第四篇：分子生物学技术与应用
第19章：分子生物学常用技术－－4学时
分子杂交、PCR、基因测序
蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)
基因转移与基因剔除(含RNA干扰) 第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时
第十九章
分子生物学常用技术
分子生物学技术能帮助我们干什么？
dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高 可探测核酸含量，但无法得知分子大小
Southern blot
Edwin Southern 创立的方法 电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA 序列的长度 可进行毛吸管转移、真空转移与电转移
影响 DNA 复性速度的因素
DNA 分子的浓度：浓度高，复性快
DNA 分子的长度：长片段复性速度慢 DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快
不同物种C0t曲线比较 人类基因组C0t曲线
二、核酸探针
Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列
探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链 探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记
电泳
转膜
杂交
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH
Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基 因的染色体定位
PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段 长度
引物设计原则
引物长度一般为 15~30 核苷酸 引物太短影响杂交体的稳定和特异性 引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降 GC 含量一般为 40％ ~ 60％ 应充分考虑退火温度(annealing temperature) GC 含量低，退火温度低，易出现非特异 GC 含量高，非特异性结合也会增加 引物解链温度粗略计算公式：
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等 与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行 缓冲液清洗 控制温度与变性剂浓度 显色 放射自显影/酶联显色
五、杂交有哪些不同的方式？
斑点杂交：dot hybridization Southern 印迹杂交：Southern blot Northern 印迹杂交：Northern blot Western blotting：不是杂交 原位杂交：in situ hybridization 反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能
DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位 RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析 蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能 细胞与整体水平：基因在活体中的功能 目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段