常用的分子生物学内容和相关技术
常用的分子生物学内容和相关技术
一、分子克隆（分子操作）
大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a
等）
融合蛋白抗原免疫动物
原核表达系统蛋白转导系统（TAT）
大肠杆菌中
2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染）
在培养的动物细胞中
分子克隆的方法：
●选择合适的表达载体
●选择酶切位点，设计PCR引物并合成
●制备待克隆的靶基因
?PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA）
?RT-PCR
?质粒中已克隆的目的片段
?人工合成cDNA片段
退火后形成双链
二、细胞培养
?动物细胞
?植物细胞
?原代细胞培养
?传代细胞培养
三、探讨功能：
与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义
?内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi,
down-regulation）或缺失、突变
?外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过
表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上
表达上调（up-regulation）
?信号传导：protein-protein interaction
◆Two hybrid system
◆Western blot
◆免疫荧光双标记图像分析
?细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis）
?动物：成瘤
四、检测表达
?DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ）
?RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA
Gene chips:cDNA,microRNAs
?Proteins
（tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）
分子生物学简介
分子生物学（molecular biology ）从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。 重点研究下述领域： （1）蛋白质（包括酶）的结构和功能。 （2）核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递。 （3）生物膜的结构和功能。 （4）生物调控的分子基础。 （5）生物进化。 分子生物学是第二次世界大战后，由生物化学,`遗传学,微生物学,病毒学,结构分析及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。 随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 生物学的研究可以说长期以来都是科研的重点，惟其所涉及的方方面面与人类生活紧密相连。本世纪50年代以前的生物学研究，虽然有些已进入了微观领域，但总的来说，主要是研究生物个体组织、器官、细胞或是亚细胞这些东西之间的相互关系。50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。到70年代，重组DNA技术的发展又给人们提供了研究DNA的强有力的手段，于是分子生物学就逐渐形成了。顾名思义，分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究；分子生物学在理论和实践中的发展也为基因工程的出现和发展打下了良好的基础，因此可以说基因工程就是分子生物学的工程应用。现在基因工程所展现出的强大生命力和巨大的经济发展潜力完全得益于分子生物学的迅猛发展，而且有证据表明，基因工程的进一步发展仍然要依赖于分子生物学研究的发展。 分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学一直是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理
分子生物学检测技术简介
分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。 2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和
分子生物学检测技术概述..
分子生物学检测技术 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述： 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA 探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交 是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。
2、Northern 印迹杂交 基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交 将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术 近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和HIV等的研究。该方法主要是通过将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上，然后依次加入待测核酸和悬挂有多个支链的信号探针进行杂交，每个支链DNA都结合有放大信号的分子(如碱性磷酸酶)，最后通过利用化学发光检测核酸的含量。bDNA技术是目前核酸直接量化检测技术中灵敏度最高的方法之
分子生物学知识框架
分子生物学 结构分子生物学部分 绪论 ①总述：进化论、细胞学说、生化遗传学、DNA的发现 ②分子生物学：定义、研究内容（四方面） ③发展史：里程碑 ④三个相关学科：生物化学、细胞生物学、遗传学 ⑤中心法则：经典、现代 ⅠDNA ①结构：碱基比率、配对规则、种数(4n)、0.34nm的应用(碱基对M/2x,长度0.34×M/2x) ?三类DNA（ABZ）：结构、形成、特点及Z-DNA的作用 ?质粒超螺旋：正负超螺旋定义、转化、意义、计算、主要以负超螺旋存在 ?其它：0.34nm的计算、※DNA稳定因素（PO43-）与Tm、Z-DNA不稳 ②性质 ?复性：五条件、机制（Cot曲线）、三个吸光度 ?修饰：甲基化（ACG） ?变性：DNA碱性全变性、90O C以上全变性增色37%、增色效应（Tm） ?水解：酸（PH<1,=4,甲基化DNA酸水解用处）；碱（RNA PH:13,11,DNA去碱基易）酶（内切、外切） ?DNA稳定因素：对应核苷酸的P同电相斥、Na+、Tm ?分子伴侣：作用、分类（热休克蛋白、伴侣素）、作用机理（四条） Ⅱ tRNA ①形成：转录成三类，3‘去尾，5’斩头，化学修饰成稀有碱基（I、ψ） ②二级结构：四个臂（受体臂、反密码子臂、D臂、TψC臂），多余臂（2类）， tRNA长度决定因素（D臂、多余臂） ③三级结构：特点、二三级氢键、两个双螺旋、转折处（）、两端点（） 受体臂与反密码子臂距离远及原因 ④功能：转运氨基酸（受体臂3‘-CCA）、解读密码子（反密码子臂） ⑤种类：tRNAi/tRNAe（起始/延伸）,同工tRNA（定义）tRNA性质由反密码子决定 Ⅲ核糖体 ①核糖体的细胞学知识：见细胞生物学 ②三个位点：A、P、E作用 ③原核30S小亚基上16SrRNA反SD序列：结构（3ˊ富含嘧啶区GAUCACCUCCUUA）、作用 Ⅳ mRNA ①真原核比较：帽、尾、单多顺反子、起始密码子个数原核有三个起始密码子 （AUG>GUG>UUG）、T1/2、原核特有SD序列 ②真核mRNA三类帽：0、1、2类定义
分子生物学与基因工程复习资料
分子生物学与基因工程 绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代” 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用。 核酸概述 1、核酸的化学组成 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别
（1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链； （4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是 按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。 （4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、 叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。
常用的分子生物学内容和相关技术
常用的分子生物学内容和相关技术 一、分子克隆（分子操作） 大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a 等） 融合蛋白抗原免疫动物 原核表达系统蛋白转导系统（TAT） 大肠杆菌中
2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染） 在培养的动物细胞中 分子克隆的方法： ●选择合适的表达载体 ●选择酶切位点，设计PCR引物并合成 ●制备待克隆的靶基因
?PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA） ?RT-PCR ?质粒中已克隆的目的片段 ?人工合成cDNA片段 退火后形成双链 二、细胞培养 ?动物细胞 ?植物细胞 ?原代细胞培养 ?传代细胞培养 三、探讨功能： 与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义 ?内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi, down-regulation）或缺失、突变 ?外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过 表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上 表达上调（up-regulation） ?信号传导：protein-protein interaction
◆Two hybrid system ◆Western blot ◆免疫荧光双标记图像分析 ?细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis） ?动物：成瘤 四、检测表达 ?DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ） ?RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA Gene chips:cDNA,microRNAs ?Proteins （tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）
分子生物学常用技术 习题
第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程） 一、选择题 （一）A型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 B ．双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 C ．单链 RNA 分子之间的杂交 D ．单链 DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组 DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ． DNA 片段 B ． cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ． RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ． DNA 印迹 B ． RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ． PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ． Western blot 中的探针是 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．抗体 E ．双链 DNA 7 ． Northern blotting 与 Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是 RNA D ．探针必须是 DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ． RNA 印迹 D ． DNA 芯片技术 E ． DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．蛋白质 E ．双链 DNA 10 ． RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ． cDNA C ．逆转录酶 D ． RNA E ． dNTP 11 ．关于 PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性 DNA 聚合酶 C ． dNTP D ．含有 Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ． DNA 链末端合成终止法不需要 A ． ddNTP B ． dNTP C ．引物标记 D ． DNA 聚合酶 E ．模板 13 ． cDNA 文库构建不需要 A ．提取 mRNA B ．限制性内切酶裂解 mRNA C ．逆转录合成 cDNA D ．将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是 GST D ．也可以是 6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为
分子生物学资料 试题及答案
星期二 2010 03 09分子生物学考试大纲 分子生物学作为生命科学领域的一门新兴学科，是以学科的相互交叉和相互渗透为基础发展起来的，其发展反过来又成为其它学科从分子水平揭示生命现象实质的强有力的工具。本学科的特点是涉及面广，知识更新快，因此本课程重点介绍分子生物学的基本理论,使学生掌握坚实宽广的基础理论知识，以适应科学技术突飞猛进的时代要求。 绪论 1. 分子生物学与药学分子生物学； 2. 分子生物学的发展的回顾； 4. 分子生物学和现代医学 第一章、遗传物质的分子结构、性质和功能 考试内容 一、核酸是遗传物质 二、核酸的结构 1、 DNA是遗传物质的携带者 1）. DNA的一级结构 2）. DNA的二级结构及其多样性 3）DNA的三级结构 4）. DNA的拓扑学性质 5）. DNA的四级结构 2、RNA的结构 1核酸的功能 一）、DNA的功能及基因治疗 二）、RNA的功能 1hnRNA 和mRNA的功能 2. rRNA的功能 3. tRNA的功能 4.scRNA 、snRNA、iRNA 、gRNA 5. 端粒酶RNA 、Ribozyme 四、核酸的变性、复性和杂交 2核酸的变性、复性 3核酸的杂交的应用 4生物芯片—基因芯片的概念、类型和应用 5反义核酸概念、技术、应用 考试要求： 【掌握】1．核酸的一级结构。 2．DNA的一、二、三、四级结构的特点，掌握原核生物DNA的超螺旋结构，真核生物染色体的基本单位-核小体的结构。DNA的生物学功能 3．RNA的种类与功能。信使RNA和转运RNA的结构特点。tRNA二级结构的特点与功能。 4．DNA的变性和复性概念和特点，解链曲线与Tm。
分子生物学技术
分子生物学技术 近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。 在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。 一、分子生物学技术 由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLI A）,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分
分子生物学常用技术考试题目及答案
1．P C R反应过程中，引物粘合所需温度一般是A．72℃ B．85℃ C．75℃ D．65℃ E．55℃ 2．PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是 A．95℃ B．82℃ C．72℃ D．62℃ E．55℃ 3．PCR反应体系不包括 A．模板DNA B．Taq DNA聚合酶C．特异性引物A、B D．ddNTP E．含Mg2+的缓冲液 4．PCR的循环次数一般为 A．5～10次B．10～15次C．15～20次D．20～25次E．25～30次 5．PCR反应体系与双脱氧末端终止法测序体系不同的是缺少 A．模板B．引物C．DNA聚合酶D．ddNTP E．缓冲液 6．Sanger法测序不需要 A．Klenow小片段B．引物C．dNTP D．标记dNTP E．ddNTP 7．Sanger法测序的基本步骤不包括 A．标记模板B．模板-引物杂交C．引物的延长与合成阻断 D．电泳E．放射自显影直读图 8．Sanger法测序的四个反应体系中应分别加入不同的 A．模板B．引物C．标记dNTP D．DNA聚合酶E．ddNTP 9．人类基因组计划的主要研究内容不包括 A．遗传图分析B．物理图分析C．转录图分析 D．序列图分析E．蛋白质功能分析 10．1996年，英国科学家克隆的Dolly羊所采用的技术是 A．转基因技术B．核转移技术C．基因剔除技术
D．肽核酸技术E．反义核酸技术 11．Maxam-Gilbert法与Sanger法测序的共同点是均需 A．引物B．Klenow大片段C．ddNTP D．化学裂解试剂E．电泳后放射自显影读图 12．Sanger法测序所得直读图像中，由终点至始点所读序列为 A．待测DNA5ˊ→3ˊ的碱基序列B．待测DNA3ˊ→5ˊ的碱基序列 C．待测DNA互补链3ˊ→5ˊ的碱基序列D．待测DNA互补链5ˊ→3ˊ的碱基序列E．引物5ˊ→3ˊ的碱基序列 13．PCR实验的特异性主要取决于 A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量 C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数14．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究 A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达 D．基因的调控E．基因的突变 15．反义核酸作用主要是 A．封闭DNA B．封闭RNA C．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能 16．有关Sanger法测序的叙述，不正确的是 A．只需标记一种dNTP B．一般应去除DNA聚合酶I 的5ˊ→3ˊ外切酶活性C．与dNTP相比阻断剂应尽可能的多D．反应时间不必太长 E．应采用超薄高压电泳 17．经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是 A．Southern blotting B．Northern blotting C．Western blotting D．Eastern blotting E．in situ hybridization
第十二章 常用分子生物学技术的原理及其应用
第十二章常用分子生物学技术的原理及其应用 一、选择题 A型题 1、用来分析蛋白质的技术是 A、Northern blotting B、Southern blotting C、Western blotting D、亲和层析 E、离子交换层析 2、用来分析DNA的技术是： A、Northern blotting B、Southern blotting C、Western blotting D、亲和层析 E、离子交换层析 3、下列哪一种不是核酸探针的标记 A、同位素标记 B、非同位素标记 C、地高辛标记 D、生物素标记 E、辣根过氧化物酶标记 4、当双链DNA经加热变性后，按下列哪种方式放置可获得单链DNA？ A、37℃水浴 B、室温 C、4℃冰箱 D、冰水或颗粒冰内 E、100℃水浴 5、与Southern blotting比较，核酸的Dot blotting中可省略的步骤是 A、电泳 B、核酸样品固定于NC膜 C、杂交信号检测 D、标记探针 E、制备样本核酸 6、原位杂交是指 A、在NC膜上进行杂交分析 B、在组织切片或细胞涂片上进行杂交分析 C、直接将核酸点在NC膜上进行杂交分析 D、在PVDF膜上进行杂交分析 E、在凝胶电泳中进行杂交分析 7、关于PCR引物的选择，下列哪项是错误的？ A、由于变性温度在95℃，故可选择具有二级结构的引物 B、尽可能选择(G+C)含量在50%左右并随机分配的引物 C、避免连续的多聚嘌呤顺序 D、反应过程中，每种引物的浓度一般在0、1 – 0、5 mol/L E、应避免两引物末端重叠形成二聚体 8、有关DNA链末端终止法的不正确说法是 A、需要dNTP B、需要ddNMP C、需要ddNTP D、dNTP:ddNTP的比例要合适 E、需要放射线同位素和荧光染料 9、用PCR技术完成对某一遗传病的疾病基因纯合性缺失的研究过程中不需要的 步骤为： A、受检者血白细胞的分离 B、白细胞DNA的制备 C、配制PCR反应体系 D、PCR反应及其产物的琼脂糖电泳 E、反应产物的SSCP分析 10、在DNA测序的化学裂解法中需要
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术?核酸分子杂交技术 ?由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ｐrｏbe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DＮA和细胞总RNＡ。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或ＲNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。? 固相杂交 ?固相杂交（soｌｉd－phase ｈｙbｒｉdizatｉon)是将变性的DNＡ固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上,再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。? 斑步杂交(dot hyｂrｉｄizａtｉoｎ）??是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或ＲNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blｏttｉng hybridizatioｎ） ?Southｅrn印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的ＤNA片段，将凝胶上的DＮA变性并在原位将单链ＤNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(ＲELP)等。 ?Ｎortｈeｒn印迹杂交:由Southeｒm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上，进行杂交反应,以鉴定基中特定mRＮＡ分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。? 差异杂交(differential hybridｉzatｉon) ?是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同ｃDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNＡ逆转录后的ｃDNA)分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低（仅5％左右),价值不大。 ?cDＮA微点隈杂交（cDＮＡmiｃroａｒray hybriｄizａtion）? 是指将cDNA克隆或cDNA的ＰCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNＡ探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。??寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotｉｄｅmicｒoarraｙhybridizatiｏn)? 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰
接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。 EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。 优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比[4]，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较
分子生物学综述(1)
糖蛋白抗肿瘤的研究进展 [摘要]糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子，是细胞的识别及体内功能多为糖蛋白介导。其独特免疫原性使其在抗肿瘤方面具显著效果。在这近几年来，糖蛋白发展迅速，本文就糖 蛋白结构、功能及抗肿瘤方面研究进展进行综述。 [关键词]糖蛋白；生物学功能；抗肿瘤； 前言糖蛋白在生物体内是重要的生物活性物质，其糖链和蛋白相互作用介导细胞的专一性识别，调控各种生命过程如受精、发育、神经系统的维持，在目前炎症及癌细胞异常增殖、自身免疫系统中起重要作用。笔者就其糖蛋白的功能、及抗肿瘤方面国内外研究现状做一综述。 1生物学功能 1－1构成α-构型血抗原的基本物质构成血型的抗原为血型糖蛋白，是一组含大量唾液酸糖链的跨膜蛋白，无论ABO血型系统或MN血型系统都是由血型糖蛋白决定。寡糖链的识别作用决定着细胞的 识别、集聚和受体作用。 1－2构成细胞表面受体，与细胞识别和黏着有关一些外源凝集素、毒素以及病原体的受体均是糖蛋白。一些植物凝集素可使血液细胞发生凝集，动物凝集素不仅在体液免疫中起作用，还和肿瘤转移作用有关[1]。不同性别性细胞相互作用成合子或聚集成组织，都以糖和与糖专一结合的蛋白质间的识别和结合为前奏，特别是与糖链的结构与识别功能有关，为医疗上避孕提供了新的可能途径[2]。利用精细胞表面糖蛋白特异结合的特性，将外源基因导入成熟精子，使外源DNA进入卵中受精，可借此产生优良品种[3]。 1－3物质运输功能一些糖蛋白如运血红蛋白、转铁蛋白受体等可与各种特有的物质结合，将其运输。糖蛋白兼有传递信息功能，在糖蛋白激素中，糖链在激素信号传入细胞过程中担负重要作用[4]。 1－4其他功能糖蛋白还和免疫反应及神经传导有关。如一种Glycodelin A糖蛋白在生殖免疫过程中，在母胎抗排斥免疫中发挥重要作用[4]。某些细胞膜的糖蛋白还有酶活性。在以上诸多糖蛋白的生理功 能中可以看出，糖链的结构起决定性的作用。 2糖蛋白抗肿瘤的国内外研究现状 从体液及各种生物中分离出的糖蛋白，具有各种抗菌、抗凝血、抗肿瘤等生物活性。糖蛋白类及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应。例如，将乳糖接到门冬酰胺酶上，利用乳糖定向归巢到肝细胞，使门冬酰胺酶进入肝细胞，可治疗肝癌。不同来源的糖链结构有相似之处，说明以体液糖蛋白代替膜上复合糖类或在高等动物以外寻找利用于人体的半抗原糖类作为药物是可能的。人体内存在一些唾液酸含量较高的糖蛋白，如α1酸性糖蛋白(AAG)和Tam-horsefall蛋白，能抑制流感病毒和宿主细胞的黏着。多数糖蛋白糖含量在20%以下，而AAG的糖含量达到40%以上[5]。AAG免疫抑制活性表现在能抑制血小板凝集，也与肿瘤有关。AAG还能与药物结合起到药物传送的作用。研究还发现了几种与肿瘤相关的糖蛋白。利用血清或尿液中糖蛋白糖链的结构异常来诊断恶性肿瘤，如利用凝集素将甲胎蛋白(AFP)分成多种糖链结构不同的异构体，可用于原发性肝癌的诊断[6]；Pg-P是一种跨膜糖蛋白，是介导乳腺癌耐药机制逆转耐药的重要靶点，近年已有不少新的逆转药物被发现并试用于临床[7]；TAG72可作为消化道肿瘤重要的血清指标；黏糖蛋白-2(MUC2)在大肠癌中的阳性率为70%[8]；CA125是胚胎发育期腔上皮表达的一种高分子糖
分子生物学与基因工程主要知识点
分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；
（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是 按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。 （4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、 叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。 DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度