生物显微技术3- 细胞化学和组织化学
生物显微技术 第三章 细胞化学和组织化学
❖ 常用方法： 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩
组织化学及免疫组织化学.(DOC)
临床病理学特殊技术第1节组织与细胞化学（histochemistry and cytochemistry）【概念】运用物理和化学的技术方法显示组织细胞结构中的各种化学成分，并对这些化学物质进行定性、定位、定量，从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化规律。
细胞化学是研究细胞的化学成分及其在细胞活动中的变化和定位的学科。
对细胞中的不同组分进行区别着色是细胞化学中最基础的工作。
组织化学是指利用细胞或组织中的某些化学成分生成有色沉淀物，对细胞组织中的这些化学成分进行定性、定位和定量分析的特殊技术方法。
细胞化学和组织化学的发展是分不开的，都是建立在细胞学、组织学以及生物化学的基础上。
【基本原理】用于组织与细胞化学研究的染料可以是碱性的也可以是酸性的。
酸性染料的生色基团是硝基和醌基；碱性染料的生色基团，包括着偶氮基吲胺基。
染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染色。
组织与细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物呈色。
常见的细胞化学物质成分染色方法见表2-1，组织化学物质成分染色方法见表2-2。
表2-1 细胞化学物质成分的鉴定* 黏多糖类是蛋白多糖分子中的糖链部分，是黏液（人体的粘膜上皮分泌出来的湿滑液体）的主要化学成分。
由于含酸基的不同，而又分为中性黏多糖（中性黏液）、酸性黏多糖（酸性黏液）和混合性黏多糖（混合性黏液）。
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。
表2-2 组织化学物质成分的鉴定色素分为人为色素和自生性色素。
人为色素是由于固定剂与组织中某些成分相作用而产生，例如福尔马林色素等。
在某些病理情况下，细胞代谢所产生的沉着的色素，如脂褐素、黑色素、含铁血黄素、嗜银颗粒及组织内的微量金属离子等，需要一些特殊染色加以证明（表2-3）。
《生物显微技术》教学大纲
《生物显微技术》教学大纲Biological Microscope课程编码：27A11701 学分： 2.5 课程类别：专业任选课计划学时：56 其中讲课：24 实验：32适用专业：生物技术推荐教材：王庆亚，《生物显微技术》，中国农业出版社，2010。
参考书目： 1. 康莲娣，《生物电子显微技术》，中国科学技术大学出版社，2003。
2. 杨星宇，《生物科学显微技术》，华中科技大学出版社，2010。
3. 张耘生，陈铭德，杨克合《生物学技术［M］》，高等教育出版社，1994。
4. 黄承芬，《生物显微制片技术》，北京科学技术出版1991。
5. 郑国昌，《生物显微技术［M］》，人民教育出版社，1978。
课程的教学目的与任务生物制片技术已经成为研究生物组织和细胞结构的一种重要方法，是从事生物、农、林、牧、医科研人员应掌握的一项基本技能。
在大学和中学，学生学习生物时，也常用生物制片技术和生物玻片标本。
因而生物制片技术在教学和科研领域被广泛使用。
通过本课程的学习，使学生了解生物制片技术的一般原理和程序，知道制片方法的分类，掌握生物制片技术的方法。
综合运用所学知识、分析和解决今后学习、实验过程中遇到的多种问题。
课程的基本要求本课程以动物显微制片技术为主，重点讲授常用的动物显微制片的方法和步骤（以石蜡切片为主），使学生具体掌握临时装片法、整体封固法、离析法、压片法、徒手切片法、石蜡切片法等动物制片的方法和步骤；能正确使用实验室常用的几种光学显微镜，对相关实验结果进行观察、分析；让学生了解激光共聚焦显微镜及其它特殊显微镜的基本知识；为学生今后从事相关工作奠定技术基础。
各章节授课内容、教学方法及学时分配建议（含课内实验）第一章：概论建议学时：2 [教学目的与要求] 通过本章教学使学生了解：生物显微技术的内容、应用、发展史。
[教学重点与难点] 生物显微技术的内容。
[授课方法] 以课堂讲授为主，课堂讨论和课下自学为辅。
[授课内容]§1.1 制片的目的和任务§1.2 制片技术的发展概况§1.3 生物制片的分类。
显微化学
第三章显微化学(microchemistry)显微化学(microchemistry)是应用某种化学处理，使组织或细胞的某一部分起化学变化而产生特殊的染色反应，将组织或细胞内的某种化学成分在组织切片内予以显示，并通过显微镜直接鉴定组织或细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布的一种方法。
它包括“组织化学(histochemistry)”与“细胞化学(cytochemistry)”两方面。
组织化学是运用化学、免疫学和分子生物学等学科的原理和知识，对组织和细胞中的化学成分、反应规律进行定性、定位和定量研究的科学和技术手段，属于一门形态学科和机能学科相结合的边缘学科。
细胞化学是化学、物理学和生物学的交叉学科，是研究细胞中无机及有机物质的定性、定量及定位的原理和方法，更重要的是研究生物大分子结构与功能的科学。
它在显微、亚显微及超微三个不同层次上揭示生物细胞的结构和及其所执行的任务（功能），涉及许多相关的大型精密仪器的原理与操作，样品制作技术、结构分辨技术、功能活性的微区分析和定位技术。
发展趋势是定量细胞化学，即在不破坏细胞形态结构的状况下，用生化的和物理的新技术对各种组分做定量的分析，研究其动态变化，了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用。
第一节注意事项(一)材料的选择很重要，不仅要直接采用新鲜或生活状态下的材料进行固定，同时还必须注意材料的不同生长时期、器官的年龄以及昼夜的差别等，这些都会影响内含物的改变；(二)为了使研究材料的内含物保持在原来的位臵和避免产生化学上与物理学上的改变，制片时经常采用徒手切片法或冰冻切片法；(三)所研究的材料要新鲜，最好是从健全的生物体上取下后立即进行制片工作；(四)鉴定时所用材料的切片宜较厚，过薄的切片反而得不到良好的结果。
但鉴定某些酶的切片，则须切得很薄；(五)在鉴定时所观察的材料必须多做几份，这样才不致因生长时期、外界条件和昼夜变动等所引起的变化而得不到正确的结论；(六)鉴定时所用试剂应注意它的特殊性，必须是对所欲鉴定的某一物质有专化特性，若同时还能对其他物质起反应，那就应设法先除去这种物质；(七)对某些物质（如核酸、酶等）的鉴定，需要同时做对照片子进行比较。
组织化学法和光学显微镜技术的进展和应用
组织化学法和光学显微镜技术的进展和应用随着科技的不断进步，人们对生物学系统解析的需求也不断增加。
在这一进程中，组织化学法和光学显微镜技术已经扮演了不可或缺的角色。
本文将就这两个领域的进展和应用进行探讨。
一、组织化学法组织化学法是一种可以在一定程度上还原生物体内细胞结构和化学成分的技术。
随着化学和生物学的交叉发展，组织化学法在细胞学、生物化学和药物研究等领域中得到了广泛应用。
组织化学技术最早应用于组织切片染色的领域。
通过对染色过程的控制和改进，现今组织切片染色技术已经可以实现对不同类型的细胞组织进行染色，快速高效地获取细胞组织的可视化信息。
值得注意的是，随着研究的深入，组织化学法也可以通过利用荧光信号，获取更加精细的化学信息，这种技术被称之为光学化学扫描技术。
除切片染色这一最常见的应用之外，组织化学技术在分子水平上的应用也日益增多。
例如，利用组织化学的技术可以实现对生物体内分子间相互作用的研究以及各种生物大分子的定量化分析。
当然，组织化学技术也有其局限性，由于组织化学技术对组织的原始结构进行修改，因此结果可能会受到一些不可忽略的影响。
二、光学显微镜技术光学显微镜技术是指通过可见光的聚焦和投影，获得各种生物样本的高清晰度图像的一种技术。
作为显微镜的一种类型，光学显微镜具有广泛的应用领域，从生命科学到材料科学，都可以发挥重要的作用。
通过光学显微镜技术观察和探测生物样本，可以实现对生物样本的非侵入式检测。
例如，目前已经有学者使用复杂的基于显微镜的技术对单细胞进行定量化的测量。
此外，由于现代生物成像技术的快速发展，一些基于光学显微镜的技术已经可以实现时间和空间上的三维成像。
这种技术的发展使得细胞生物学的研究变得更加全面和深入。
三、进展和应用在过去的几年间，生物显微镜和组织化学技术的发展变得越来越迅速。
随着技术的不断更新和突破，各种新型成像技术开始脱颖而出，其中包括单分子局域化显微镜（SMLM）、二次谐波显微镜（SHG）和激光共聚焦显微镜（LSCM）等。
组织生物学的研究方法
组织生物学的研究方法随着科技的日新月异，生物学领域的研究也越来越深入。
其中，组织生物学作为一门关注细胞、组织和器官水平的分子生物学，其研究方法也不断发展。
本文将围绕组织生物学的研究方法展开论述。
一、光学显微镜光学显微镜是组织生物学研究中最基本的手段，其原理是利用光线在透镜系统中折射、聚焦，使样品中的细胞和组织在显微镜下变得可见。
通过光学显微镜的观察，可以观察到细胞和组织的形态、颜色和结构。
不过，光学显微镜的分辨率有限，只能观察到大约0.2微米大小的细胞器，无法看到更小的分子水平结构，因此需要其他高分辨率的技术辅助。
二、荧光显微镜荧光显微镜是一种基于荧光染色技术的高分辨率显微镜。
其原理是将带有荧光物质的样品在特定波长下发射荧光，使样品中的细胞和组织在显微镜下呈现出不同的颜色和光亮程度，从而揭示细胞和组织的形态和内部结构。
这种技术可以在极小的空间范围内检测和定位细胞分子和细胞器，并可动态观察活细胞和组织的反应过程。
荧光显微镜已成为生物学研究中不可或缺的工具之一。
三、电子显微镜相比光学显微镜，电子显微镜的分辨率更高，可以观察到更小的分子水平结构，例如细胞核、线粒体、内质网等。
电子显微镜的原理是利用电子束代替光线，通过电子透镜的聚焦作用使样品中的细胞和组织在镜头下呈现出高分辨率的图像。
这种方法适用于研究生物大分子的形态和亚细胞结构，如细胞骨架、微小管、细胞膜等。
四、组织化学组织化学是利用某些化学反应引起组织或细胞成分的某些改变，从而用来检测或标记组织或细胞中某些结构和分子的技术。
例如，可以使用抗体对细胞膜上的一种蛋白进行染色，以便观察该蛋白的分布和表达水平。
组织化学技术还可以用来检测细胞培养中的污染物和细胞分化的程度，以及诊断肿瘤的类型。
五、基因组学随着现代基因组学的快速发展，组织生物学的研究正转向更广泛和更全面的层面。
基因组学是研究所有基因组的结构、功能和演化的学科，包括基因组测序、转录组学、蛋白质组学等。
化学显微镜技术在生物学研究中的应用
化学显微镜技术在生物学研究中的应用随着科学技术的不断进步，生物学已经从过去简单的观察与描述阶段发展到了更加深入的研究阶段。
其中，化学显微镜技术成为了当今生物学研究中的重要手段之一。
化学显微镜技术可以用来观察细胞和分子，进而揭示生命活动的奥秘。
本文将介绍化学显微镜技术在生物学研究中的应用，并讨论它对人类生命科学领域的贡献。
一、化学显微镜技术的基本原理化学显微镜技术主要包括原子力显微镜、扫描隧道显微镜与荧光显微镜等。
其中，荧光显微镜应用最为广泛。
它利用荧光染料的发光特性，通过对细胞、分子等进行特异性标记，能够检测细胞组分的分布、运动、交互关系等。
生物学中最常用的荧光染料有荧光素、荧光素同工异构体和荧光蛋白等。
这些染料或蛋白表达在细胞或组织中，可以在荧光显微镜下被检测到。
荧光显微镜中使用的激光是单色光束，能够较好地区分不同荧光标记的染料蛋白。
二、化学显微镜技术在生物学研究中的应用1. 细胞内分子互作的研究在生物功能研究中，生物大分子之间的互作是非常重要的。
化学显微镜技术可以在非侵入性情况下直接观察分子之间的相互作用。
例如，利用荧光显微镜技术可以在单一的细胞内检测细胞透明质酸与受体的相互作用情况，这有助于探究受体激活、信号共享、突触信号转导、细胞凋亡等生物学过程的本质。
2. 动态过程的研究生命体系涉及到许多动态过程，如细胞的分裂、运动、形态改变等等。
相对于传统显微镜，化学显微镜技术具有更高的空间和时间分辨率，因此能够在更高的分辨率和时间范围内对生命过程进行观察。
荧光显微镜技术在细胞分裂、神经元突触信号传导等动态过程研究中已经被广泛应用。
3. 基因编码蛋白的研究基因编码蛋白是生命活动中不可或缺的组分。
基因编码蛋白与其分布以及内部结构的研究对于发现许多疾病的机制非常重要。
化学显微镜技术可以通过对融合荧光标签蛋白的标记物进行探索，绘制生命体中各种基因编码蛋白的分布图。
通过这种方法，可以更好地研究细胞内的蛋白质组成和各种基因编码蛋白的转运、定位等过程。
生物显微技术进展ppt课件
Max Knoll(1897-1969)
Ernst Ruska(1906-1988)
一、显微技术发展简史
一、显微技术发展简史
1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微 镜(SEM)。
一、显微技术发展简史
1982年，诺贝尔化学奖授予卓越的电镜应用者——英国的分子生 物学家克卢格（A Klug）。
➢有效放大：对于某一显微镜来说，在其分辨能力之内的图像放 大。此时的图像放大不失图像表面的细节。
➢无效放大：在显微镜分辨能力以外的图像放大。只是放大了图 像轮廓，不能放大和分辨图像的表面细节。 可见光照明的显微镜分辨率的极限值约为200 nm ，一般人正常 眼的分辨率为0.2mm，使用光学显微镜可以使我们分辨清楚细胞 的微细结构细节提高了1000倍，这正是光学显微镜的极限放大倍 数，如果再追求更大倍数也只能是空放大（无效放大），并不能 使细节更为清晰。
一、显微技术发展简史
17 世 纪 中 叶 ， 英国的罗伯特· 胡克（用自己 制造的显微镜 观察软木切片， “细胞”）和 荷兰的安东尼· 冯·列文胡克 （制造了只有 一片凸透镜的 显微镜，放大 了300倍）都对 显微镜的发展 作出了卓越的 贡献。
一、显微技术发展简史
1695 年惠更斯设计成功二片式目镜，这就是至今仍采用的惠更斯 目镜。
二、普通显微镜和特殊光学显微镜
利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可 观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、 分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，膜电 位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细 胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代 强有力的研究工具。
切片法
徒手切片法 石蜡切片法 冰冻切片法 组织化学制片
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组织化学源自比利时植物学家RaspaiI(1830年)发表 《在生理学中使用显微镜观察化学物质》的论著。 初期(1830-1870年)的组织化学主要解释生物界中的 生理现象。 (l890-1920年)随着显微镜的改进和组织化学染色技术 的发展，组织化学开始脱离生理学而趋向于阐明组织 细胞的结构及化学组成，即从生理组织学的概念转为 显微化学。 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
显示蛋白质的汞-溴酚蓝法
显示碱性蛋白质的碱性固绿法
显示蛋白质结合性氨基的茚三酮- Schiff反应
显示酪氨酸、色氨酸、组氨酸的偶联四氮盐反应
四、脂类染色法
组织中的脂类
：单纯脂类 (脂肪酸)、醇的化 合物(如:甘油三脂等)、 复合脂类 [如磷脂(卵 磷脂,脑磷脂) ]、脂类（鞘磷脂）、 糖脂(脑 苷脂,神经苷脂) 、衍生脂类（胆固醇）、 肾 上腺素 、性激素 显示脂类的基本原理 ：用易溶于脂类的染料, 使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的 脂类着色.
过碘酸-Schiff（PAS）反应法
基本原理：过碘酸（periodic acid）是一种氧化剂，它可把 多糖的葡萄糖分子两个相邻的带有羟基的-C-C-键打开，而生 成醛基再与染色剂结合。Schiff试剂中的碱性复红(fuchsin basic)是一种混合物，经亚硫酸和二氧化硫的作用，醌式结 构的双键被破坏而消失，成为无色复红，再经过氧化后的醛 基与无色复红液进行结合呈紫红色。
实验举例:苏丹黑B法 原理：苏丹黑为偶氮染料,具有脂溶性,可溶于无水酒精,但不溶于 水(常用70%酒精饱和液)。当组织切片入染液时,苏丹黑B便离开 染液而溶于组织内的脂质(如脂滴中)使组织内脂类着色。 标本: 兔肾上腺和睾丸横冷箱切片,10μm厚,不固定(或用 10%Formalin固定10分钟后水洗)。 方法 ：① 入蒸馏水洗 ② 于70%乙醇内涮洗 ③ 入苏丹黑B 70%B饱和液,染5～10分钟 ④ 于50%酒精内浸洗 ⑤ 蒸馏水中洗 ⑥ 入Mayer苏木精(复染细胞核)1分钟 ⑦ 自来水冲洗5～10分钟 ⑧ 入蒸馏水 ⑨ 甘油明胶(或Apathy糖胶)封固 结果：细胞内脂滴均呈黑色
(二)常用的固定方法
1、浸泡固定法：将固定液置于0一4C冰箱中预冷， 检材浸入冷固定液中2一12小时(在冰箱中进行)或者 更长。 2、原位冷固定法：将动物麻醉后，在活体情况下， 在组织上加冰后，一边快速取材，一边向组织器官 滴加预冷的固定液，检材取出后，再用浸泡法固定 30分钟-1小时，甚至更长时间。 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
2、结果：糖原及PAS反应阳性物质为红色；其他为紫蓝色。
3、注意事项 (1)Schiff液的配制是本方法的关键，否则将不显色。
(2)SO2充分时，能使碱性品红变成无色品红，此时配出来的 溶液呈淡黄色清亮液体，可以省去活性炭吸色这一步骤。在 使用中染液逐渐变无色。 (3)反应的强弱与氧化的时间及氧化的强度有关。过碘酸的浓 度不宜过高，氧化时间不能太短，也不能太长，要适当掌握。 一般氧化10-12分钟。 (4)一定要做好对照。
注意事项：
（1）
对照切片的制做 （2） 固定剂的选择：一切好的组织学固定 剂均适用于Feulgen反应，以OsO4和 Carnoy效果较好 （3）水解时间：适当的水解时间一般为 8~12min。 （4）Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的 染色反应。 （5）5%亮绿淡复染，使胞浆及其它组织呈 绿色。
组织死亡后，糖原很快就分解为葡萄糖，迅速取材、固定是 非常重要的。 该染色方法不仅能显示糖原。而且还能显示中性黏液性物质 和某些酸性黏液性物质，以及脑垂体、神经髓鞘、脂质色素、 淀粉祥物质、基膜、软骨及真菌等等。
1、染色步骤 (1) 经常规组化固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液固定组 织。 (2) 常规石蜡包埋、切片、脱蜡至水。 (3) 1%过碘酸液氧化10分钟。 (4) 自来水充分洗3分钟，蒸馏水过洗。 (5) 入Schiff液10一20分钟(遮光)。 Schiff液的配制：碱性品红1g ，蒸馏水(煮沸) 200mI，振荡5 分钟，冷却至50℃过滤，加入lmol/LHCl20ml，冷至25 ℃时 加偏重亚硫酸钠4~6g， 遮光放置12一24小时后，加入活性炭 (吸色) 2g(若液体颜色较淡可省去此步)，摇荡1分钟后过滤， 将滤液遮光保存在0~4 ℃处备用。 (6)自来水流水冲洗15一20分钟，显色(红色)。 (7)苏木精复染5分钟。 (8)流水冲洗5一10分钟。 (9)常规脱水、透明、封片。
2、改良的甲基绿-派洛宁法
甲基绿-派洛宁染色的原理并不十分明了，有
的学者认为甲基绿染DNA，派洛宁染RNA不 是化学作用，而是两种核酸的聚合程度，甲 基绿染高聚分子的DNA，而派洛宁染低聚分 子的RNA。而有的学者认为，甲基绿和派洛 宁在水中分离后，都产生带正电荷的离子， 甲基绿电离后产生两个正电荷，碱性较强， 与细胞核结合；派洛宁电离后产生一个正电 荷，碱性较弱，与细胞质结合。
以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 1、操作步骤
(1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 (2)核固红染液染色2一10分钟。 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩 下约0.25g核固红残余物，再溶于蒸馏水100ml。 (3)蒸馏水稍洗，常规脱水透明，中性树胶封片。 2、结果：钙盐沉积处红色；其他组织深浅不同的淡粉红色。 3、注意事项 (1)钙盐易被酸性溶液溶解，适宜于用中性甲醛溶液固定，固 定时间不宜过长，以免甲醛溶液酸化影响结果。 (2)铁妨碍钙的显示，要避免使用铁质容器。
l、Baker甲醛-钙固定液(固定时间2~4/小时) 商品甲醛10ml，10%氯化钙l0ml，蒸馏水80ml， 此固定液为细胞和组织化学技术中最常使用的固定 液，适合各种染色方法。 2、Lillie磷酸缓冲-甲醛液 3、多聚甲醛-磷酸缓冲固定液(多聚甲醛效果优于甲 醛) 4、戊二醛磷酸缓冲固定液(固定时间1 ~ 60分钟，适 用于电镜) 5、甲醛-蔗糖-磷酸缓冲固定液(适用于多糖类及蛋白 质) 以上固定液都必须在冷的环境下(0~ 4℃ )工作。
第三节 有机物的检测方法
一、糖类染色方法 糖类广泛存在于机体的组织中，化学成分复
杂，种类繁多，分为单糖、多糖、黏多糖、 糖蛋白、黏蛋白、糖脂。 糖原是天然存在的多糖，为储存糖；大量存 在于肝细胞、骨骼肌、心肌内。糖类容易溶 解于水，因此不能选择水溶性固定液固定组 织。 糖原的常规染色为过碘酸-Schiff（PAS）反 应法
三、制
片
涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法
最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A· R级)。 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或 酶的各种特性，做到胸中有数，正确分析实验结果。
常用方法：
苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
第三章 细胞化学和组织化学
细胞化学和组织化学(cytochemistry and histochemistry)技术是以细胞学、组织学为基础， 运用物理的和化学的方法来显示细胞组织结构中各 种化学物质(如无机物、脂类、蛋白质、维生素、 核酸、酶等)的定性、定位、定量的技术，从而分 析、研究生物在生理或病理状态下，细胞和组织的 代谢、功能及形态的变化规律。
二、固
定 固定既要最有效地保存细胞、组织内的化学 成分和酶的活性，防止其弥散、移位、溶解、 丢失，同时还必须保持细胞、组织良好的形 态结构，防止细胞、组织收缩、膨胀、变性、 自溶。因此，根据组织内的化学物质、酶的 特点，选择适宜的固定剂是非常必要的。
(一)常用的细胞和组织化学固定剂的配制
第一节 细胞化学和组织化学的基本方法
与常规的组织学方法一样，细胞化学和组织化学 方法也同样需要经过取材、固定、制片、染色等 过程，只是要求更加严格。
一、取材 组织块不宜过大，光镜标本一般为 1.5cm×lcm×O.3cm大小，电镜标本的大小约在 0· 5mm左右。 酶组化之目的使用时，最好在低温的环境下 (0~4℃)操作。
DNA大部分存在于细胞核中，是遗传的物质基础。 RNA、 DNA的显示的常用方法有Feulgen法、甲基绿派洛宁法等。
1、Feulgen法
反应原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分 子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端 出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与 醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因 醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是 说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还 原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合 物，从而显示出DNA的分布。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3