位点特异整合型微环DNA的实用性

1.LR重组反应在LR克隆酶作用下,亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PP发生重组反应,形成微环DNA和微质粒(图1)。

LR重组反应体系为:亲本质粒200ng、10×TE缓冲溶液1μl、LR克隆酶2μl、加ddH2O至10μl。

反应条件:25℃,4h。

1.
2.4转染HeLa细胞将HeLa细胞消化传代至12孔板,于细胞汇合度为80%~90%时进行转染。

参照转染试剂GenJetPlus说明书进行。

主要步骤如下:移除培养液,以PBS冲洗细胞2遍,加入600μl无血清DMEM培养液。

然后配制转染复合物:在1.5mlEP管内加入DNA混合物,以无血清DMEM补足50μl,混匀。

实验组DNA 混合物为未纯化的LR重组体系10μl和4倍于微环DNA物质的量的pPGKPhiC31obpA质粒。

对照组DNA混合物为与微环DNA等物质的量的对照质粒和5倍于对照质粒物质的量的pPGKPhiC31obpA质粒。

因实验组LR重组产物中含有与微环DNA等物质的量的表达ΦC31整合酶的微质粒,故上述实验组及对照组DNA混合物中微环DNA及对照质粒的物质的量与ΦC31整合酶质粒物质的量比值均为1:5。

在另一1.5mlEP管中按照DNA(μg):转染试剂(μl)为1:3的比例加入GenJetPlus转染试剂,以无血清DMEM补足50μl,混匀。

将上述转染试剂稀释液加入DNA混合物中,轻轻吹打混匀,室温静置20min后,将100μl转染复合物逐滴加入12孔板中,轻轻摇匀。

另设不转染质粒的空白对照组。

转染12h后,换新鲜的含血清DMEM培养液继续培养。

2.LR重组效率测定以EcoRI酶切pEGFP-PP的LR重组产物来鉴定重组反应的发生:若发生重组,则微环DNA(pEGFP-MC)和微质粒分别被线性化,得到约2.0和5.3kb两条带;若未发生重组,则亲本质粒被切成约1.2和6.1kb两条带。

以PvuⅡ酶切验证pTPO-PP的LR重组:若发生重组,则能切出约2.7kb(pTPO-MC)和 5.3kb(微质粒)两条带;若未发生重组,则能切出约1.9和6.1kb两条带。

可通过观察电泳图中各条带亮度粗略判断LR重组效率。

此外,应用荧光定量PCR方法检测各质粒的拷贝数可较为精确地计算LR重组效率。

在亲本质粒λattR 两端设计引物MC-F和λattR-R(序列见表1)扩增该质粒的特有片段,检测亲本质粒的拷贝数;同时,设计引物MP-F和MP-R(序列见表1)扩增LR重组反应前后拷贝数不变的片段,作为定量PCR内参。

以ddH2O替代LR重组反应体系中的LR克隆酶作为LR重组反应前样品。

将两组亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PPLR重组反应前后样品分别稀释100倍和1000倍进行荧光定量PCR,通过标准曲线法进行绝对定量,比较LR重组反应前后亲本质粒的拷贝数,获得LR克隆酶的重组效率。

3结果
3.1LR重组效率鉴定结果酶切鉴定电泳结果显示,重组体系中微环DNA和微质粒的条带亮度明显高于亲本质粒(图2A),直观地表明LR重组效率较高。

荧光定量PCR检测结果可见,由两组亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PP的两个稀释梯度得出LR重组效率为82.56%±0.76%(表2)。

GFP阳性细胞克隆中LR重组片段PCR鉴定结果表明,随机挑选的27个GFP 阳性细胞单克隆中有23个为微环DNA整合(图2B、图2C),即LR克隆酶重组效率为85.19%(23/27),与荧光定量PCR结果一致。

3.2转染率的测定结果流式细胞分析结果显示,微环pEGFP-MC的转染率显着高于传统质粒pEGFP-C,为其3.66倍(2
4.80%±10.21%vs.6.77%±1.61%,P=0.039,3次独立实验,图3A)。

3.3整合率的测定结果转染2周后,克隆计数并计算外源基因在细胞基因组中的整合率。

结果显示,微环pEGFP-MC和传统质粒pEGFP-C的整合率分别为0.82%±0.11%和0.52%±0.07%(图3B)。

虽然微环DNA的整合率仅为传统质粒的1.58倍,但两者相比有显着统计学差异(P=0.014,3次独立实验)。

3.4蛋白表达水平的测定结果以流式细胞仪检测经PCR鉴定为微环DNA整合的23个细胞克隆以及对照组pEGFP-C整合的8个细胞克隆的GFP荧光强度,分别为(958.60±328.11)和(137.99±83.46)(图3C),前者为后者的6.95倍,有极显着统计学差异(P<0.001)。

此外,ELISA检测pTPO-MC和pTPO-C在转染后不同时期hTPO的表达水平,结果如图3D所示。

转染2、4.5、7、9.5d时,微环pTPO-MC 组hTPO蛋白表达水平均明显高于传统质粒组,前者为后者的4~12倍,有统计学差异(P<0.05,3次独立实验)。

然而,pTPO-MC转染组和pTPO-C转染组分别在转染后第14.5天和第12天收集的培养液上清中即无法检测到目的蛋白hTPO的表达。

4讨论ΦC31整合酶系统可介导含链霉菌attB位点及外源基因的质粒载体整合于哺乳动物基因组的假attP位点处。

序列特征分析表明,假attP位点与野生型attP位点有一定的序列相似性,且多位于基因间或内含子区域[13]。

因此,外源基因在假attP位点处的整合使得靶细胞基因组被破坏的风险明显低于随机整合,安全性有所提高。

此外,由于该系统介导的目的基因整合后具有较好的表达水平,因而在基因治疗领域得到了广泛的应用[14]。

但上述整合会将质粒载体上的细菌骨架序列也带入基因组,仍然存在安全隐患[2]。

微环DNA是由传统质粒在大肠杆菌内通过位点特异性重组将其抗性标记基因、复制原点等细菌序列删除而得到的一种小环超螺旋分子,具有较高的转基因表达水平和安全性[3]。

经典的微环DNA制备方法是以阿拉伯糖诱导重组酶的表达,重组酶介导其识别位点发生重组,形成含细菌骨架的微质粒和含目的基因表达盒的微环DNA,微环DNA必须与微质粒分离才能得到进一步的应用[3]。

近年来,微环DNA的制备方法得到了多种改进[9,15]。

与传统采用阿拉伯糖诱导方法不同的是,Tasic等[9]成功地利用LR克隆酶在体外反应中获得了微环DNA。

然而,经典的阿拉伯糖诱导方法[16]和采用LR克隆酶制备微环DNA时[9],为将微环DNA与微质粒分离,需要酶切消化微质粒和残留亲本质粒、纯化回收微环DNA等操作,微环DNA的产率很低。

虽然优化的阿拉伯糖诱导法的微环DNA产率有所提高[15],但其需要特定的工程菌株。

为避免上述问题,本文联合应用LR克隆酶和ΦC31整合酶系统,结合两个系统的优势,建立了一种获得位点特异整合型微环DNA的方法:借助LR克隆酶将细菌骨架序列删除后,利用ΦC31整合酶系统实现目的基因的位点特异性整合。

由于在利用ΦC31整合酶系统实现外源基因位点特异整合时,必须将含有attB位点和目的基因的质粒与表达ΦC31整合酶的质粒进行共转染[14],因此本文在构建亲本质粒时在微质粒部分连入了ΦC31整合酶表达盒,使该微质粒在后续的转染实验中可被有效利用,而无需与微环DNA分离。

该亲本质粒经LR重组后获得的微环DNA与表达ΦC31整合酶的微质粒的物质的量之比为1:1。

我们的研究表明,在含attB位点质粒物质的量固定的情况下,共转染表达ΦC31整合酶质粒的物质的量越高,整合效率越高(两者比例在1:1~1:50的范围内,未发表数据)。

因此,为保证实验中目的质粒有较高的整合效率,本文在将LR重组反应产物直接转染HeLa细胞的同时,额外加入4倍于微环DNA的表达ΦC31整合酶的质粒进行共转染,使含attB位点质粒与表达整合酶质粒的物质的量之比达到1:5(与对照组一致)。

实验表明,LR克隆酶可高效介导亲本质粒的LR重组,微环DNA的产率达到80%以上,产物中微环DNA与残留亲本质粒的物质的量之比为(4.38±0.44),是优化的阿拉伯糖诱导方法[15]的近3倍(4.38/1.51,P<0.001)。

且该LR 重组产物无需纯化,可直接转染HeLa细胞系,避免了回收过程中的损失,大大减少了实验操作步骤和时间。

未来可尝试对LR重组反应程序进行优化,如LR克隆酶分批加入、增加LR克隆酶用量以及延长反应时间等,尽可能提高微环DNA的产率,减少残留亲本质粒的含量。

ELISA 及流式细胞分析结果显示,与传统质粒相比,微环DNA转染组的目的蛋白GFP和hTPO均呈现明显的高表达状态,这可能与微环DNA具有较高的转染率以及不含细菌骨架序列有关[17]。

然而,微环pTPO-MC在转染后第14.5天收集的培养液上清中即无法检测到目的蛋白hTPO的表达。

这可能是由于微环DNA不含真核筛选基因,细胞在未加压传代生长过程中,整合外源基因的细胞逐渐被具有生长优势的未整合细胞淹没。