金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay,DICA)
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析技术原理介绍胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatography Test）是一种常用于快速、便捷地检测生物体内特定分子的方法。
该技术基于免疫层析原理，利用胶体金颗粒作为信号指示剂，实现对目标分子的高灵敏检测。
原理胶体金免疫层析技术主要依赖于抗原-抗体的专一性识别和相互结合。
当胶体金颗粒与特异性抗体结合后，形成颗粒/抗体/抗原复合体。
通过将样品与含有抗原的试剂盒进行反应，可使目标分子与胶体金颗粒上的特异性抗体结合，形成颗粒/抗体/抗原/目标分子复合体。
操作步骤使用胶体金免疫层析技术进行检测通常需要以下步骤：1.样品处理–收集待测样品，并进行必要的前处理，例如离心、稀释等。
–如果样品是固体，需要先进行溶解或悬浊处理。
2.反应溶液的制备–根据试剂盒的说明书，将试剂溶解或稀释到适当的浓度。
3.准备试剂盒–打开试剂盒包装，并将提供的试剂按照指示加入到试剂盒中。
4.加样–使用专用的吸管或滴管，将处理好的样品滴入试剂盒的样品孔中。
5.反应–让样品与试剂盒中的抗体共反应一定时间，通常为几分钟。
6.拍照解读–将试剂盒放置在专门的解读器上，并对结果进行解读。
–解读器会对胶体金颗粒的颜色进行分析和判断，从而得出检测结果。
7.结果判读–根据解读器显示的结果，确定样品中目标分子的存在与否。
–通常，胶体金免疫层析技术结果可分为阴性、阳性或无效，具体判读标准需根据试剂盒说明书确定。
优势和应用领域胶体金免疫层析技术具有以下优势和应用领域：1.快速：检测时间短，通常在几分钟内可以得出结果。
2.简便：操作简单，无需复杂的设备和专业技术人员。
3.准确：具备高灵敏性和特异性，可以有效地识别目标分子。
4.可视化：结果直接显示在试剂盒上，无需显微镜等设备。
5.应用广泛：可以用于临床医学、环境检测、食品安全等多个领域。
局限性和发展趋势胶体金免疫层析技术虽然具有许多优点，但也存在一些局限性：1.灵敏度限制：相比于其他方法，如PCR和ELISA，胶体金免疫层析技术的灵敏度相对较低。
第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
LA T E R A L FLO W T E S T S T R IP O F V E D A LA B
30
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的抗 体1＋标本中待测 抗原＋金标记的 抗体2显色
• 用于测抗原
原 • 是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术 理 • 将结合各的种以反应微试孔剂滤分膜点为固载定体在的测快试速版的相固应相
• 通区膜域过免，毛疫检细分测析管标作技用术本加使在样试品纸溶条 液的 在一 层端析材料 上泳动，样本中的待测物与层析材料中 的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特 定区域（检测线），通过标记抗体显色
§ 最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为 载体的免疫测定技术
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术具有简单、快速、灵敏等特 点，得到了广泛应用
§ 20世纪90年代兴起的胶体金免疫层析技术，特 别是试纸条的发展，使操作更加方便快捷
§ 胶体金标记免疫检测技术在临床医学检测、激 素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速 检测，以及抗原抗体分析等诸多领域迅速发展
食品 食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精
安全 各监管部门
等）,大肠杆菌,黄曲霉素
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
—
瘦 肉 精
克 伦 特 罗
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
—
兽 药
恩 诺 沙 星
致病菌--大肠杆菌O157
即时检测技术的概念、原理与分类
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四、POCT技术的分类
（二）多层涂膜技术 多层涂膜技术是从感光胶片制作技术引申而来
的，也属于干化学测定，将多种反应试剂依次涂布 在片基上并制成干片。这种干片比运用简单显色技 术的干化学纸片均匀平整，用仪器检测，可以准确 定量。
按照干片制作原理的不同，可分为采用化学 涂层技术的多层膜法和采用离子选择性电极原理的 差示电位多层膜法。
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多层涂抹技术化学法干片结构及功能示意图
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四、POCT技术的分类
2．差示电位多层膜法 该类仪器使用的膜片包括两个完全相同的“离子
选择性电极”，均由离子选择敏感膜、参比层、氯 化银层和银层组成，并以一纸盐桥相连。
测定时取血清和参比液分别加入并列而又独立的 两个电极构成的加样槽内，即可测定两者的差示电 位。
2
• 即时检测（point-of-care testing,POCT)技术作为检验医学的 重要组成部分，不仅提高了检验速度和方便程度，并具有实 验仪器小型化，操作方法简单化，结果报告即时化等优点， 在检验医学中得到了较大的发展和应用。
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一、POCT的概念
• POCT是指在病人旁边分析病人标本的分析技术， 或者说只要测试不在主实验室做，并且它是一个可 移动的系统，就可以称为POCT。
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比P较O项CT目与传统实验P室O检CT测的主要传不统实同验点室检测
周转时间
快
慢
标本鉴定 标本处理
血标本 操作步骤
校正 试剂 检测仪 对操作者的要求 单个试验花费 试验结果质量
简单 不需要 多为全血
简单 不频繁 随时可用
简单 普通人亦可以
高 一般
免疫层析法 胶体金法
免疫层析法胶体金法免疫层析法（Immunoassays）是一种常用的生物化学分析方法，可以用来检测和测量样品中的特定分子。
它基于抗体和抗原之间的特异性相互作用，利用这种相互作用来检测和量化感兴趣的分子。
胶体金法（Colloidal Gold）是一种常用的免疫层析法的检测方法。
它利用胶体金颗粒的特殊性质，结合抗体和抗原的特异性相互作用，实现对目标物质的定性和定量分析。
免疫层析法的原理是利用抗体与抗原的特异性结合，从而实现对目标物质的检测。
在胶体金法中，胶体金颗粒被偶联上特异性的抗体，形成胶体金标记物。
当样品中存在目标物质时，胶体金标记物会与目标物质结合形成免疫复合物。
这个免疫复合物可以通过免疫层析膜迁移，最终形成可见的条纹或颜色变化。
胶体金法的优势在于其操作简便、结果直观、灵敏度高和特异性好。
它可以应用于多种领域，如临床医学、食品安全、环境监测等。
在临床医学中，胶体金法常用于检测生物标志物，如肿瘤标志物、感染性疾病的病原体等。
在食品安全领域，胶体金法可以用来检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等。
在环境监测中，胶体金法可以用于检测水体、土壤等环境样品中的污染物。
使用胶体金法进行免疫层析分析的步骤一般包括样品预处理、胶体金标记物的制备、样品与标记物的反应、免疫层析膜的制备以及结果的读取和分析等。
首先，需要对样品进行预处理，如提取、纯化或稀释等，以获得适合分析的样品。
然后，制备胶体金标记物，将特异性抗体与胶体金颗粒偶联。
接下来，将样品与标记物反应，使目标物质与胶体金标记物结合形成免疫复合物。
然后，将反应混合物加载到免疫层析膜上，免疫复合物会随着溶液的迁移在膜上形成条纹。
最后，通过肉眼或专用的读取设备对条纹进行观察和分析，根据条纹的颜色、强度和位置等来判断目标物质的存在与浓度。
虽然胶体金法在免疫层析分析中具有许多优点，但也存在一些局限性。
首先，胶体金颗粒的稳定性较差，容易聚集和沉积，影响结果的准确性和可重复性。
免疫检验 第十一章 固相膜免
检测蛋白质
检测激素 检测药物
41
小
结
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以 微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性， 像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体 也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用 这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固 相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免 疫层析试验、斑点ELISA 、免疫印迹法。
• 又称酶联免疫电转移印迹法（EITB）， • 又称Western-blot 。 • SDS-PAGE高分辨率＋Ag-Ab反应的高特异性
36
(一)原理
37
（二）技术要点
– SDS-PAGE
– 电转移
– 酶免疫定位
应用：因可确定蛋白组份的分子量，可用
于分析抗原组份及其免疫活性，也可用 于疾病的诊断，如AIDS的确诊试验
2
第一节 胶体金免疫技术
(colloidal gold immunoassay)
胶体金也称为金溶胶，是金盐被还原成
金原子后形成的金颗粒悬液。
稳定性
• 胶体金胶粒间的相互吸引力 • 胶体金胶粒及其溶剂化层的带电情况 • 胶体界面的溶剂膜
聚沉现象 : 电解质 \ 温度 \ 浓度
3
（二）胶体金的制备
2. 抗原抗体反应
– 滴加样品血清 – 洗涤后滴加酶标二抗
3. 显色反应
– 滴加底物
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（三）方法学评价
1. 灵敏度高（因NC膜吸附蛋白的能力强，所以 比普通 ELISA 高6～8倍） 2. 省试剂（比ELISA节约10倍） 3. 操作简便，不需特殊设备 4. 结果可长期保存（－20℃半年）
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二、免疫印迹法（IBT）
操作方法
第十一章金免疫技术【52页】
三、临床应用与评价
1. 应用 （1）细胞的膜表面抗原 （2）细胞胞/组织内抗原 （3）组织中或亚薄切片中抗原 (4) 病毒检测或病毒分型
2.评价
（1）优点：标本用量少,敏感性高，特异性好, 标本用量少,可进行双标或多标检测。
原理：
免疫反应
胶体金颗粒(CG)沉积在Ag位置
CG 催化，对苯二酚还原剂
银离子(Ag+) 还原成 银原子(Ag)
银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”
子
“银壳”催化，还原更多银离
“银壳”越长越大,抗原位置得到清楚放大
（二）操作技术要点
1.试剂：免疫金、配制新鲜配制银染液。 2.检测：多用于抗原检测。
目前得以广泛应用。
第一节 胶体金与免疫金的制备
1. 胶体金的制备 2. 免疫金的制备 3. 免疫金的保存
1.1胶体金的结构
胶体金是由金盐被还原成 原金后形成的金颗粒悬液。
胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au） 及包围在外的双离子层构成(内层AuCl2－， 外层H+）。
金颗粒间静电相互排斥而悬浮形成一种稳定 的胶体状态。
DIGFA
穿流（flow through）
DICA
横流（lateral flow）
(二) 方法类型
1.双抗体夹心法 2.竞争法/抑制法 3.间接法
1.双抗体夹心法
？
免疫层析试验双抗体夹心法测
双抗体夹心法
标本
Gold
test
control
结果观察
Gold
阳性
test control
临床免疫学：胶体金免疫分析
反应线 质控线
阳性
阴性 23
操作技术要点
A
B
DIGFA——双抗体夹心法测抗原 24
DIGFA——结果判断
InstantChek HIV 1+2的结果判断 (图 像)
阳性
阴性
测定无效
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胶体金免疫层析试验
（ dot immunogold chromatographic assay, DICA)
G
T
C
26
夹心法 双抗原夹心法
双抗体夹心法
抑制法(竞争法） 间接法
27
胶 （体
金 免 疫 层 析 试 验
dot immunogold chromatographic
assay,DICA )
双抗体夹心法
阳性结果
标本
G区：金标特异性 抗体(兔型)
T区：特异 性抗体
吸水纸
C区：羊
抗兔Ig
28
29
ICA 结果观察 阳性 阴性 无效
体
-
+
金
-
+
白 质
-
+
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免疫金的制备
制备要点 ➢ PH值的调整：原则上可选择待标记蛋白质等
电点，也可略为偏碱 ➢ 蛋白质最适标记量的确定 ➢ 标记过程 ➢ 离心纯化：超速离心法 ➢ 免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存 ：稳
定剂-PEG，BSA
16
对
蛋白量逐渐减低
照
管
待标记蛋白作系列稀释+定量胶体金+Nacl 最适标记量：能保持红色不变而蛋白含量最
标本 Ab
Ab*
Ag
标记物 放射性核素
荧光素 酶
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金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）
1．原理
金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DI CA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体
的快速的固相膜免疫分析技术。
本项技是将各种反应试剂分点固定在
试纸条上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶
液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生
特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。
本项技术的特点是可进行单份
标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常迅速。
2.方法学类型
DICA多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。
常见方法学类型有：
1)双抗体夹心法测抗原：
若图-2所示，G处为金标抗体(免疫金)，T处包被抗体，C处包被抗金标
抗体，B处为吸水纸。
测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测
标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-
抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。
图-2免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原
2）竞争法测小分子抗原：
若图1-3所示,G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗免疫金抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处
时结合金标抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的金标抗体与膜
上标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，实验结果为阴性。
图-3免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
3）间接法测抗体：
为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图-4)。
图-4免疫层析试验测抗体原理图
测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为与蛋白结合的有色染料，F处吸水材料；左面中央开有观察窗口 B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、D处为吸水材料。
测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性IgG及无关物被洗回E处，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。
无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。
该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。
3．实验材料
临床上有现成试剂盒供应，试剂盒主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上(如图15-2)，试剂条的底板为单面胶塑料片, 层析条为多孔聚乙烯、硝酸纤维素、玻璃纤维素
材料，A、B两端粘贴吸水性强的滤纸等材料。
G为干燥固定在玻璃纤维
膜等材料上的胶体金结合物。
T为粘附有已知的抗体或抗原，C处粘附
有质控品(抗免疫金抗体)，T、C点物质往往以直线的形式包被在膜上。
4．技术要点
实验操作非常简单其操作要点为：
1）将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5秒或在标本加样处加
一定量待检标本，平放于水平桌面上。
2）5-20分钟内观察结果。
3）结果判断：阴性：出现一条棕红线质控条带，阳性：出现两条
棕红线条带，试剂失效：无棕红线条带出现。