pET表达系统
pET表达载体
表达载体pETA.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和pI 启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。
pET 表达系统包括质粒和宿主菌。
您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。
B.使用许可及协议Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。
详情请垂询。
C. 系统组成pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。
pET原核表达系统
• 在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表 达方式，均需协调一致、共同表达，使各表达产物的分子比例 适当，从而正常发挥功能。
三、乳糖操纵子结构
三、乳糖操纵子结构
The Lac Operont But Not Lactose
Hey man, I’m constitutive CAP
乳糖操纵子的调控机理
•
四、pET原核表达系统概况 原核表达系统概况 • pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大 的系统。 • 目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译 (可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
四、pET原核表达系统概况 原核表达系统概况 • T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性： 在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录； 充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。 • 用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的 蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定。
Come on, let me through
Repressor
Binding
RNA Promoter Operator Pol.
Repressor
LacZ
LacY
LacA
Repressor mRNA
No way!
Repressor
CAP
The Lac Operon:
When Lactose Is Present But Not Glucose
二、基因表达方式
• 根据生物对内外环境刺激的反应，将基因表达的方式分为： 组成型表达
诱导或阻遏型表达
协同表达
组成型表达（ 组成型表达（constitutive gene expression） ） • 在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表 达，无论表达的水平高或低，它受环境因素的影响较少、或变 化很小。 且基因表达产物通常是对生命过程必需的、必不可少 的，这类基因通常被称为持家基因（housekeeping gene）。 • 举例： Homo sapiens ribosomal protein S27a (RPS27A),mRNA4156 Homo sapiens actin, beta (ACTB), mRNA6988 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LDHA), mRNA2105
生长抑素(SS)基因在pET232表达系统中的高效表达
生长抑素(SS)基因在pET 232表达系统中的高效表达刘永庆1,刘文波1,潘杰彦1,杜念兴1,陈溥言13,赵国屏2(11南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京210095;21中国科学院上海生物工程研究中心,上海200233)摘要:分别将SS 基因克隆至p ET 32a 和p ET 32c 表达系统中,得到重组质粒SS 2N/X 和SS 2N/S 。
实验结果表明,SS 2N/X 2Thioredoxin (硫氧还原蛋白)和SS 2N/S 2Thioredoxin 融合蛋白在IPTG (异丙基硫代βD 半乳糖苷)诱导3h 后(37℃)表达产量最高,约占菌体总蛋白的30%左右。
0105～1mmol ・L -1IPTG 对SS 融合蛋白表达产量的影响并不太大,0105mmol ・L -1IPTG 即可达到有效的诱导效果,但单位体积内的表达产量以015mmol ・L -1时为最高。
乳糖诱导4h (37℃)的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至8h 时,20mg ・mL -1的乳糖可达到与IPTG 同样的诱导效果,10和5mg ・mL -1的乳糖也可接近IPTG 的诱导效果。
SS 2N/X 融合蛋白在26℃表达时,主要以可溶性形式存在,占7518%,包涵体仅占2412%;而SS 2N/S 融合蛋白则主要以包涵体形式存在,占6012%,可溶性蛋白仅占3918%。
SS 可溶性融合蛋白具有良好的SS 抗原性。
关键词:生长抑素(SS );p ET 32表达系统;异丙基硫代βD 半乳糖苷(IPTG );乳糖;融合蛋白中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01006105Cloning and expression of somatostation (SS)genein E 1coli pET 232expression systemL IU Y ong 2qing 1,L IU Wen 2bo 1,PAN Jie 2yan 1,DU Nian 2xing 1,CHEN Pu 2yan 13,ZHAO Guo 2ping 2(1.Key Laboratory of Animal Diseases Diagnosis &Immunology ,Ministry of Agriculture ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.Shanghai Biological EngineeringResearch Center ,Chinese Academy of Sciences ,Shanghai 200233,China )Abstract :The SS gene was cloned into the p ET 232a and p ET 232c expression system respectively 1Two recombinant plasmids SS 2N/X and SS 2N/S were gained correspondingly.After exposure to IPTG (at 37℃)for 3h ,both of SS 2N/X and SS 2N/S fusion protein expression were accounted for approximately 30%of the total cellular proteins 1The expression level of SS fusion proteins was not significantly altered when the IPTG concentration was varied from 0105mmol ・L -1to 1mmol ・L -11The expression level was monitored after inducing with lactose and IPTGfor 4h.The ex pression level was lower with lactose induction when com pared to that with IPTG.However ,if the induction time was prolonged to 8h ,20mg ・mL -1lactose had similar effect as that of IPTG ,even at lower concentration (510mg ・mL -1)1It showed that 0105mmol ・L -1IPTG could give the satisfactory result.7518%of the SS 2N/X fusion protein was soluble ,while only 3918%of the SS 2N/S fusion protein was soluble at 26℃.Thesesoluble SS fusion proteins had higher antigenicity 1K ey w ords :somatostatin ;p ET 232expression system ;IPTG (isoproylthio 2β2D 2galactoside );lactose ;SS fusion protein垂体生长激素(GH )的分泌受下丘脑GH 释放因子(GHRF )和生长抑素(SS )的双向调控,前者促进GH 释放,后者则抑制GH 释放。
原核表达系统pET28a(+)中抗CD20微抗体的构建和表达
Ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｎ ａ ｄＥ ｐ ｅｓ ｎ ｏ ｔ Ｃ Ｏ Ｍｉｉｏ ｙｉ Ｅ ２ ａ ｏ ｏ ｓ ｃｉ ｎ ｘ ｒｓｉ ｆＡｎｉ Ｄ２ ｎｂ ｄ ｎｐ Ｔ ８ （＋ ｆ ｒ ｏ ｏ —
Ｐｒ ｋａ ｙ ｔｃ Ｅｘ ｅ ｓｏ ｓｅ ｏ ｒ ｏ ｉ ｐｒ ｓｉ ｎ Ｓｙ ｔｍ
第３ ５卷第 ３期 ２１ ０ ２年 ９月
南 京 师 大学 报 （ 自然科 学 版 ）
Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ａ ＪＮ Ｏ ＭＡ Ｎ Ｖ Ｒ ＩＹ（ ａ ｒｌ ｃｅｃ ｄｔｎ Ｏ Ｒ Ａ ＦＮ Ｎ Ｉ Ｇ Ｎ Ｒ ＬＵ Ｉ Ｅ ＳＴ Ｎ ｔ ａ Ｓｉ ｅＥ ｉｏ ） ｕ ｎ ｉ
ｔ ｅ ｂ ｓ ｄ ｃ ｎ ｏ ｄｔ ｎ ｏ ｓｓ ｌ ｂ ｅｐ ｏ ｅｎ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ．Ｍｅｈ ｄ Ｔ ｅ ｒ ｃ ｍｂｎ ｎ ｎ ｂ ｄ Ｄ ｓ ｐ ｏ ｕ ｅ ｙ ｈ ｅ ｔ ｎ ｕ ｉ ｇ ｃ ｎ ｉ ｏ ｆ ｔ ｏ ｕ ｌ ｒ ｔ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｉ ｉ ｉ ｔ ｏ ｈ ｅ ｏ ｉ ａ ｔ ｍｉ ｉ ｏ ｙ ｃ ＮＡ ｗａ ｒ ｄ ｃ ｄ ｂ
再将 ＳＦ ｃ ｖ和人源 ＩＧ Ｈ ｇ １Ｃ ３通过人源 ＩＧ 铰链 区连成 ｍｉ ｂｄ ｇ１ ｎ ｏｙ的 ｃ Ｎ 将 其克隆至表达 载体 ｐ Ｔ ８ （＋） ， ｉ Ｄ Ａ． Ｅ ２ａ 中 并在大肠杆菌中用 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导表达．结果 ：Ｄ ．Ａ Ｅ和 Ｗｅｔ ｎｂｏ 结果表 明， Ｃ ２ Ｓ ＳＰ Ｇ ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ 抗 Ｄ ０的微抗体基 因表达产 物
［ 摘要 ］ 目的： 改造 Ｒｔｘ ａ ， ｉ ｉ ｂ 构建包含 Ｖ 、 Ｈ和 Ｃ ３的抗 Ｃ ２ ｕｍ ＬＶ Ｈ Ｄ ０微抗体 ｍ ｎ ｏｙ 并探 索诱导其 可溶 性表达 ｉｉ ｄ ， ｂ
的最佳方法．方法 ： 首先通过 ｏｅ ａ Ｃ ｖｒ ｐＰ Ｒ将 Ｒｔｘ ｂ的 Ｖ ｌ ｉ ｉ ｕ ｍａ Ｌ和 Ｖ Ｈ通过 Ｌｎ ｅ 连接在一起 ， ｉ ｒ ｋ 成为单链抗体 ＳＦ ， ｃｖ
pet系统表达原理
Pet系统表达原理概述Pet（Personal Enrichment Tool）系统是一种集成功能强大且高度可定制的虚拟宠物系统，旨在为用户提供一种互动、陪伴和娱乐的体验。
其基本原理是将虚拟宠物与用户进行实时的语义交互，通过语音、图像或文本输入与输出来模拟真实宠物的行为和情感，创造出与用户的情感互动。
1. 宠物角色设定Pet系统的第一步是设定一个虚拟宠物角色，包括宠物的种类、外观、性格等属性。
这些属性可以基于用户的偏好进行定制化设置，从而使每个用户的宠物角色独特而个性化。
2. 语义理解Pet系统通过语义理解技术对用户的输入进行解析，以理解用户的意图和需求。
语义理解可以基于自然语言处理（NLP）和机器学习技术，对用户的语音、图像或文本输入进行分析，提取其中的信息并将其转化为可理解的形式。
3. 建模与推理Pet系统通过对用户的输入进行建模与推理，将其映射到相应的行为和情感。
系统可以基于规则、知识图谱或深度学习等技术，建立宠物的行为模型和情感模型，通过推理引擎对用户的输入与宠物模型进行匹配，并确定宠物应该作出的反应和行为。
4. 输出回应Pet系统根据推理结果，将生成的回应呈现给用户。
回应可以是语音、图像或文本形式，以与用户进行互动。
系统应根据用户的输入和上下文生成具有情感色彩的回应，使对话更加真实和情感丰富。
5. 交互引擎Pet系统的交互引擎负责整个系统的运行和管理。
它包括用户界面、输入输出处理、上下文管理、情感模型管理等功能模块。
交互引擎需要保证系统的稳定性、高效性和可扩展性，以提供流畅的用户体验。
6. 学习和适应性Pet系统可以具有学习和适应性能力，通过与用户的互动和反馈，不断改善模型和算法，提升系统的智能程度。
系统可以记录用户的偏好和行为历史，并根据这些数据进行个性化推荐和定制化设置，使系统更加适应用户的需求。
7. 附加功能除了基本的表达原理，Pet系统还可以提供一系列附加功能，使用户体验更加全面。
默克密理博pET原核表达工具简介
多亚基蛋白表达、目的蛋白-辅因子共表达 变得灵活、简便可控
11
16/05/2014
pET系列载体：满足各种表达要求
Strep•Tag ® II：pET-51,-52；提高纯度，>95% HRV 3C： pET-47,-48,-49,-50；低温切割保护蛋白 NusA： pET-43.1, -44, -50b；提高可溶性 GST： pET-41,-42；提高可溶性，纯化，活性检测 Trx： pET-32；提高可溶性 site-specific 32P-labeling： pET-33；目的蛋白标记 Peptide Expression： pET-31，小肽表达
5
16/05/2014
重要原则：选择合适的载体
• 提高产量和稳定性 • 蛋白定位与分泌 • 可溶性
• 特异性亲和纯化
• 检测**
pET系列
融合标签：
• 不同大小的C-或N-端 标签的不同功能与对 后续操作的影响 • 是否需要或容忍标签 的存在
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16/05/2014
重要原则：选择合适的载体
pET系列
强势而可控
pET系列
T7Lac启动子 加强严紧控制 以获得更稳定 的表达
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16/05/2014
重要原则：选择合适的载体
pET系列
终止子：转录水平的
终止，也可考虑翻译 水平的终止
重要原则：选择合适的载体
pET系列
多克隆位点：
• pET系列共同的设计 便于亚克隆
• 决定了载体来源序列 在蛋白产物上的位置 和应用
Submit Query Reset
Type (or cut and paste) your protein sequence below, click on the "Submit" button, and the solubility probability of your protein will be calculated. The statistical model predicts protein solubility assuming the protein is being overexpressed in Escherichia coli. If there are numbers, spaces, or other characters in your sequence, don't worry, they won't affect the calculation. For more information on the solubility model used here, see the references below. References: •R.G. Harrison. 2000. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations. 11:4-7. PDF file •Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. and R.G. Harrison. 1999. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 65(4):382-8. PubMed Abstract •Wilkinson, D.L. and R.G. Harrison. 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology. 9: 443-448. PubMed Abstract
pET表达系统说明书(Novagen公司)
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III. Cloning Inserts in pET Vectors
A. Ligation B. Transformation Handling Tips Procedure Plating Technique C. Analysis of pET Recombinants ® Transcription/Translation Analysis with EcoPro™ or STP3 Systems Plasmid Templates PCR Templates Ligation PCR for Transcription/Translation Analysis Colony PCR for Transcription/Translation Analysis Colony Screening Plasmid Miniprep Procedure Sequencing
Novagen
1
pET System Manual
Use of Ampicillin Precautions to Maximize Expression Rationale for Plasmid Stability Test F. Difficult Target Proteins Other Factors Influencing Expression Level 33 33 34 34 36
United States & Canada 800-207-0144 Germany 0800 6931 000 United Kingdom 0800 622935 Or your local sales office
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pet 32a 表达条件
pet 32a 表达条件
PET32a质粒在过去几十年中被广泛应用于蛋白表达和纯化领域。
以下
是PET32a质粒的一些主要应用：
1. 异源蛋白表达：PET32a质粒可以用来表达各种异源蛋白，包括重组蛋白、荧光蛋白等。
通过将目标基因插入MCS区域，宿主细胞会转录
和翻译该基因，并产生目标蛋白。
2. His标签纯化：由于PET32a质粒中含有His标签序列，因此可以使用亲和性树脂结合His标签，将目标蛋白高效纯化。
3. T7表达系统：PET32a质粒中的T7启动子可以与T7 RNA聚合酶结合，并导致高效的基因转录。
这使得PET32a质粒成为一个理想的工具，用于大规模生产需要大量目标蛋白的实验。
4. 原核和真核表达：PET32a质粒可以在不同类型的宿主细胞中表达目标基因，包括大肠杆菌等原核细胞和哺乳动物细胞等真核细胞。
在利用PET32a质粒进行蛋白表达时，需要注意以下条件：
1. 确保外源DNA片段插入到PET32a质粒中，形成正确的表达载体。
2. 选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌BL21(DE3)等，以确保蛋白质
的正确表达。
3. 在宿主细胞中转入表达载体，并确保其在天然条件下进行蛋白质转
录和翻译。
4. 可以使用亲和性树脂结合His标签，进行蛋白质纯化。
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pET表达系统的原理
使用乳糖或乳糖类似物进行诱导表达，表 达的时机完全由人为决定，可控性强。
可控制的 表达
强大、灵活的 pET表达系统
低本底的 表达
非诱导培养条件下，采用一 定的措施可以使目的基因完 全处于沉默状态而不转录。
高效率的 表达
充分诱导时，几乎所有的细 胞资源都用于表达目的蛋白 ；诱导表达后仅几个小时， 目的蛋白通常可以占到细胞 总蛋白的50%以上。
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内容介绍
1 2 3
乳糖操纵子的正负调控 T7 RNA 聚合酶 pET表达系统
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乳糖操纵子的结构
I
operator P O
lac operon
Z
Y
A
Lac I 阻遏蛋白
β-半乳糖苷酶
Lac 通透酶
Lac 乙酰转移酶
lacUV5
与cAMP-CAP复合体的亲 和能力大大降低
lac
lacUV5
在没有cAMP-CAP复合体 的情况下能更好的转录
只受lacI阻遏蛋白调控
Nanjing Normal University
T7 RNA聚合酶
来源
• λ(DE3)噬菌体，单链蛋白。
专一性 转录效率
• 只识别λ噬菌体启动子，不识别大肠杆菌启动子。
cAMP水平过高，从而刺激 lacUV5启 动子指导T7 RNA聚合酶的转录。
本底表达
培养基
培养基中存在乳糖。
Nanjing Normal University
Thank You!
Nanjing Normal University
• 噬菌体启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别。
• RNA的合成速度是大肠杆菌RNA 聚合酶的5倍
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pET系统表达原理
未诱导的情况下
E.Coli 基因组
lacUV5 T7 RNA Polymerase gene
目标基因 lacI 阻遏蛋白 T7 启动子 pET
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乳糖操纵子的负调控
诱导物不存在时 I
I mRNA I mRNA翻译出的阻遏蛋白结合到启动子部位， 阻止lac 操纵子基因的转录
P
O
Z
Y
A
诱导物存在时 I
I mRNA
P
诱导物
O
lac
诱导物与阻遏蛋白结合使阻遏蛋白无法与启动子结 合，转录顺利进行，表达相应的酶
Nanjing Normal University
乳糖操纵子的正调控
cAMP CAP
在细菌饥饿时，胞内的cAMP浓度会上升，与CAP 结合促使后者活化。蛋白复合体可以结合到lac启 动子区域，提高启动子的转录效率。
I
P
诱导物
O
lac mRNA
Z
Y
A
诱导物
Nanjing Normal University
Nanjing Normal University
pET系统表达原理
诱导的情况下
E.Coli 基因组
lacUV5 T7 RNA Polymerase gene
目标基因
lacI 阻遏蛋白
pET
乳糖或IPTG
T7 启动子
Nanjing Normal University
pET系统的本底表达
cAMP过高